Что такое NK клетки. Естественные (натуральные) киллеры крови (NK-клетки) Повышено абсолютное число натуральных киллеров

Аннотация

NK-клетки характеризуются как не В-клетки и не Т-клетки, лишённые характеристик зрелых макрофагов, которые развиваются из клеток костного мозга независимо от влияния тимуса. NK-клетки играют решающую роль в гибели опухоли, иммунологическом надзоре, сопротивляемости инфекциям и иммунном регулировании процессов организма. Разрушение нормальными киллерами раковых клеток включает в себя определенную последовательность событий. Во-первых, клетка NK распознает раковую клетку и привязывается к ней. Этот процесс требует межрецепторного взаимодействия. NK-клетка выделяет гранулы, которые проникают в раковую клетку и в конечном итоге убивают ее. После чего NK-клетка освобождается для привязки к другой раковой клетке и процесс повторяется.

Однако раковые клетки знают, как вести своего рода клеточную войну. Мы впервые в нашей лаборатории открыли, что раковые клетки могут уничтожать лейкоциты посредством фагоцитоза. Мы наблюдали три способа, которыми это делается. Раковая клетка может окружить с двух сторон лейкоциты или может создать чашеобразное отверстие, внутрь которого затягиваются лейкоциты. Третий способ заключается в том, что раковая клетка вытягивает длинное плечо, чтобы захватить лейкоцит и, в конце концов, затянуть его внутрь раковой клетки, где он переварится. Кроме того, другие работы показали, что раковые клетки выделяют иммуносупресивные вещества, которые ослабляют функцию иммунной системы.

За последние 25 лет были сделаны многочисленные попытки укрепления иммунной системы с помощью различных модификаторов биологической реакции (МБР). Эти вещества, создаются из бактерий и грибков, которые обладают иммунорегуляторными свойствами. Кроме того, некоторые виды цитокинов работают подобно МБР, например, интерфероны, интерлейкин-2 и интерлейкин-12. Есть две проблемы, связанные с этими МБР: 1) токсичность, 2) развитие низкой реактивности, при которой однократное введение МБР может значительно повысить активность клеток NK, но повторное введение того же МБР приведет к депрессии активности NK-клеток. Интересно отметить, что BioBran имеет преимущества перед другими МБР. Он нетоксичен и не показал низкой реактивности за четыре года наблюдений. Настоящая работа была проведена с целью изучения влияния нового МБР, известного под названием BioBran, на функцию NK-клетки и пролиферацию Т-и В-клеток у 32 пациентов. У отдельных пациентов были зарегистрированы опухолевые антигены.

Пациенты

Настоящее исследование проводилось на 32 пациентах страдающих от раковых заболеваний. У пациентов были различные типы опухоли: простаты, молочной железы, множественная миелома и лейкемия. Большинство пациентов прошли через циторедукцию при помощи традиционных видов терапии, таких как хирургическое вмешательство, лучевая терапия или химиотерапия.

Материалы

BioBran – это арабиноксилан, полученный из экстракта рисовых отрубей, обработанный под воздействием ферментов из грибов шиитаке. Это полисахарид, который содержит гемицеллюлозу. Торговое название BioBraп – BioBran MGN-3 (компания Daiwa Pharmaceuticals, Co., Ltd., Токио, Япония).

Методы

Протокол лечения. Пациентами давали BioBran (3 г в день) ежедневно перорально.

Опухолевый специфический антиген (ОСА). ОСА для каждого типа опухоли измерялся до начала лечения препаратом BioBran и через месяц после лечения.

Линия опухолевых клеток. К562, клетки эритролейкемической линии человека, использовались в качестве целевой. Опухолевые клетки культивировались в полной среде, состоящей из RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% антибиотика (100 единиц пенициллина и 100 г\мл стрептомицина).

Препарат лимфоцитов периферической крови (ЛПК). ЛПК были приготовлены из свежей гепаринизированной венозной крови путем центрифугирования в градиенте плотности Ficoll-Hypaque. Клетки были два раза промыты сбалансированным солевым раствором Хенкса и ресуспендированы до концентрации 10 х 106 кл\мл в общей среде.

51CR – анализ для измерения активности NK-клеток. Активность нормальных киллеров измерялась стандартным 4-х часовым 51CR- анализом. Вкратце, 1х104 опухолевые целевые клетки, меченные Cr в 0.1 мл обшей среды добавлялись в различные лунки 96-луночного титрационного планшета. Затем клетки-эффекторы пипеткой переносились в ячейки в 4 копиях, чтобы получить соотношение клеток-эффекторов к целевым клеткам (E:T) 12:1, 25:1, 50:1 и 100:1. После 4 часового инкубационного периода при температуре37 °C, планшеты были центрифугированы (1 400 об\мин в течение 5 минут) и было собрано 0.1 мл центрифугата из каждой лунки и пересчитано по гамма-счетчику (Beckmann G50, Beckmann Instruments).

Процент освобождённых изотопов рассчитывался по следующей формуле:

Спонтанное освобождение из целевых клеток составило не боле 8-10% от общего освобождения. Общее освобождение измерялось прибавлением 0.1мл Тритона Х-100 (Sigma Chemical Co.) в назначенные лунки. Единицы лизиса рассчитывались из кривых титрования эффектора с одной определённой единицей лизиса, так как требовалось, чтобы количество клеток-эффекторов достигло 20% лизиса для К562.

Гранулярность естественных киллеров. Выделение лимфоцитов периферической крови в градиенте перколла было настроено на 2.5=10.6\мл и центрифугировано на слайдах при 1 000 об\мин в течение 5 минут при помощи цитоцентрифуги (Shanton Southern Institute, Сеуикли, Пенсильвания). Слайды были высушены в воздушной сушке, фиксированы метанолом, окрашены 5% раствором Гимзе в течение 10 минут. Окрашенные препараты были изучены на предмет гранулярности NK-клеток.

В естественных условиях пролиферация T-лимфоцитов и В-лимфоцитов. Мы исследовали влияние в естественных условиях BioBran на пролиферацию Т-клеток и В-клеток при помощи тимидина. Мононуклеарные клетки были подготовлены из периферической крови пяти раковых пациентов до лечения BioBran и через месяц после лечения. Клетки были инкубированы при 2х105 кл\мл в общей среде. Клетки были обработаны фитогемагглютинином (10г\мл), конканавалином А или митогеном лаконоса в течение 3 дней. На последние 18 часов к культурам клетки был добавлен меченый тритием тимидин. Были собраны образцы ДНК и определено накопления тимидина при помощи сцинтиллоскопа. Все эксперименты проводились в трех повторениях, данные выражены, как число импульсов в минуту.

Статистический анализ. Т-критерий Стьюдента применялся для изучения значимости отклонений между активностью NK-клеток и реакцией Т- и В-клеток на митогены до и после лечения препаратом BioBran.

Результаты

1. Активность NK -клеток

Рисунок 1 показывает базовые значения цитотоксичных ответов NK-клеток у 32 пациентов, больных раком. У пациентов отмечался общий низкий уровень функции NK-клеток. Депрессия активности NK-клеток наблюдалась у пациентов с разными типами опухолей: простаты, 11.1 единиц лизиса; молочной железы 11.4 единиц лизиса; множественная миелома, 7.3 единиц лизиса; лейкемия 4.3 единиц лизиса. Исследования лимфоцитов периферической крови у 12 участников спустя 1-2 недели после первичного исследования, не выявили статистически значимых различий в активности NK-клеток по сравнению с первоначальными результатами. Лечение MGN-3 показало значительное повышение активности NK-клеток до десяти раз. Усиливающий эффект MGN-3 был выявлен при всех типах опухолей: простаты 41.9 единиц лизиса; молочная железа 33 единиц лизиса; множественная миелома 31.9 единиц лизиса; лейкемия 51.4 единиц лизиса.

Рисунок 1. Влияние BioBran на активность NK-клеток у 32 пациентов от одной до двух недель после лечения. Типы опухолей: простата (10), молочная железа (12), множественная миелома (5), лейкемия (5). Единицы лизиса при 20% *р < 0.001

2. Гранулярность NK -клеток.

Препарат цитоцентрифугирования лимфоцитов периферической крови до лечения показала низкую гранулярность или ее отсутствие (рис.2а).

Рисунок 2(а) . Препарат цитоцентрифугирования лимфоцитов периферической крови. NK-клетки были взяты от ракового пациента до начала лечения BioBran. Обратите внимание на ядерно-плазменное отношение и отсутствие гранул.

Рисунок 2(b ). Препарат цитоцентрифугирования лимфоцитов периферической крови того же пациента через 1 неделю после лечения BioBran. Клетки демонстрируют высокое гранулярное содержание.

С другой стороны, лечение BioBran показало значительное повышение гранулярного содержания через 1 неделю после лечения (рис. 2b). Активированные BioBran NK-клетки показали повышение связывающей способности и способности уничтожать раковые клетки (рис. 3).

Рисунок 3. Препарат цитоцентрифугирования опухолевой клетки К562. NK-клетки были активированы BioBran. (а) Первый шаг процесса представлен связыванием NK-клетки к клеткой опухоли. (b) Одна опухолевая клетка мертва. (с) Обе опухолевые клетки мертвы, а NK-клетка все еще активна. (d) NK-клетка самостоятельно отделяется от мертвых опухолевых клеток.

3. Пролиферация в естественных условиях Т- и В-лимфоцитов

Рисунок 4 показывает, что лечение BioBran значительно повысило пролиферацию Т-клеткок, это показывает реакция на митогены: фитогемагглютинин и конканавалин А. Пролиферация В-клеток также повысилась после лечения BioBran, о чем свидетельствует реакция на митоген лаконоса, по сравнению с базовым значением.

PHA – фитогемагглютинин, Con A - конканавалин А, PWM - митоген лаконоса

Рисунок 4. Действие BioBran в ответ на митоген. Т- и В-клетки через месяц после лечения. Мононуклеарные клетки были культивированы из периферической крови в присутствии фитогемагглютинина, конканавалина А и митогена лаконоса. Данные представляют среднее значение (стандартное отклонение у пяти человек.) *р<0.001.

4. ОСА и активность естественных киллеров у отдельных пациентов

Пациентов проверили на предмет опухолевого специфического антигена: простата, простат специфический антиген (ПСА); множественная миелома, белок Бен-Джонса (ББД) или ICg. Рак молочной железы проверялся при помощи РЭА и КТ сканирования от одного до двух раз в год. Был проведен анализ различных типов злокачественных опухолей у отдельных пациентов.

Пациент К, 39 лет. Был поставлен диагноз острый миелогенный лейкоз. Была проведена химиотерапия, в результате которой число лейкоцитов составило 5.6, при норме от 4.5 до 10.5. Химиотерапия была прекращена и пациент начал принимать BioBran в январе 1995 года. Показатели лейкоцитов оставались в норме с того времени. Активность NK-клеток пациента составила 7.9 единиц лизиса и повысилась до 113 единиц лизиса через одну неделю после лечения BioBran. Уровень активности NK-клеток остается высоким уже в течение 4 лет.

Пациент Y, 52 года, менеджер магазина из Японии. Ему также был поставлен диагноз острый миелогенный лейкоз. Он отказался от традиционного лечение. Количество лейкоцитов 31 марта 1998 года составило 18 700\мл. Пациент начал принимать BioBran.и 30 апреля число лейкоцитов упало до 11 000. С того времени его состояние остается стабильным.

В 1994 году R обратился к нам по поводу рака простаты. Гормональная терапия привела к тому, что уровень ПСА был 0.1, но известно, что маркёр со временем снова повышается. Пациенту начали давать BioBran.и уровень ПСА остается в норме последние 4 года.

М, пациентка, у которой возник рецидив рака молочной железы в апреле 1995 года. До этого ей была проведена операция, за которой последовала химиотерапия. Она начала прием BioBran после завершения курса химиотерапии и с тех пор компьютерная томография показывала хорошие результаты. Больше не было признаков рецидива заболевания, согласно компьютерной томографии и биопсии. Активность NK-клеток пациентки составила 16.4 единицы лизиса. Это увеличенные в два раза показатели после одной недели лечения BioBran. Активность продолжала увеличиваться до 128 единиц лизиса и остается на высоком уровне в последние годы.

Обсуждение

BioBran считается сильным модификатором биологического ответа, о чем свидетельствует повышенная активность NK-клеток у животных и человека. Интраперитонеальная инъекция мышам BioBran показала повышение активности NK-клеток в несколько раз через два дня после лечения. Другие исследования на крысах, в которых BioBran применялся вместе с пищей, также показал повышение активности NK-клеток в зависимости от применяемой дозы. Исследования проводились и на здоровых участниках, которые принимали BioBran перорально. Повышение активности NK-клеток в 2-3 раза наблюдалось через неделю после лечения BioBran в дозе 30 и 45 мг\кг в день, а более низкие дозы 15 мг\кг в день показали повышение активности в два раза только через месяц.

По нашему мнению, особенный интерес представляет исследование стимулирующего влияния BioBran на активность NK-клеток у пациентов с наличием злокачественного новообразования. Пациенты прошли химиотерапию и лучевую терапию, так как требовалась циторедукция. Однако в результате этих воздействий активность естественных киллеров снижалась. Учитывая потребность организма в естественном иммунитете, мы поняли, что усиление активности NK-клеток может оказаться клинически крайне важным для уничтожения оставшихся раковых клеткок, которые не были уничтожены во время лучевой и химиотерапии. Возможно усилить активность NK-клеток за счет применения различных модификаторов биологического отклика. Однако токсичность и низкий иммунологический ответ ограничивают их применение. BioBran является безопасным продуктом, у пациентов не развивалась устойчивость к иммуному ответу на препарат во время 4 лет проведения исследования. За активностью NK-клеток велось наблюдение, чтобы можно было задокументировать все изменения в активности циркулирующих иммуноцитов во время терапии с данными препаратами. Было выявлено усиление активности NK-клеток благодаря BioBran уже через 1-2 недели после лечения, и эта активность удерживалась на высоком уровне при продолжении лечения BioBran.

Циторедукция, за которой следовала иммунотерапия BioBran применялась к 32 пациентам, больным раком. Кроме повышения активности NK-клеток, пациенты показали постепенное снижение уровня опухоль специфического онтигена без признаков увеличения в течение 4 лет, пока проводилось исследование.

Изучались механизмы, благодаря которым BioBran повышает активность NK-клеток. Согласно нашим исследованиям, два механизма отвечают за активность NK-клеток, вызванную BioBran. Во-первых, это происходит за счет гранулярности NK-клеток, во-вторых – за счет повышения производства цитокина. Что касается гранулярности, NK- клетки наших пациентов имели либо низкую гранулярность, либо ее полное отсутствие. Примечательно, что лечение BioBran значительно повышало гранулярное содержание NK-клеток (Рис. 2). Гранулы располагаются не только в порции цитоплазмы, но также и между ядерными и клеточными мембранами. Экзоцитоз гранул NK-клеток и секреция молекул, формирующих поры (перфорины), хранящиеся как цитоплазмические гранулы могут представлять один из важнейших механизмов для уничтожения клеток рака системой NK-клеток. Важная роль гранул при уничтожении опухолевых клеток NK-клетками была выявлена при наблюдении за изолированными и очищенными гранулами. Они обладают разлагающим воздействием на разные типы опухолевых клеток. Следовательно, мы полагаем, что повышенный уровень гранулярности NK-клеток является важным фактором для усиления клеточного ответа на гибель рака благодаря применению BioBran.

Что касается цитокинов, было выявлено, что сразу несколько цитокинов влияют на пролиферацию NK-клеток или на цитолитическую активность. Большему изучению подверглись интерфероны и ИЛ-2. Подавление активности NK-клеток у раковых пациентов была связана с недостаточным производством лимфокина. Предположительно, усиление цитотоксической функции NK-клеток за счет введения BioBran совпадает со значительным повышением уровней различных цитокинов. Грануляция больших гранулярных лимфоцитов может указывать на секреторную функцию. Пока не известно является ли производство различных лимфокинов полифункциональным свойством подгруппы больших зернистых лимфоцитов. Более вероятно, что различные подгруппы больших зернистых лимфоцитов ответственны за различные лимфокины. В лабораторных исследованиях было выявлено, что лечение BioBran значительно повышает производство ФНО-альфа и интерферонов. Кроме того, пациенты с различными типами злокачественных опухолей показали повышение уровней ИЛ-2, ИЛ-12, ФНО-альфа после лечения BioBran.

Наша работа показала первичный эффект BioBran на NK-клетки. Однако есть данные, полученные от здоровых контрольных участников исследования, что другие иммуноциты, Т- и В-клетки показали усиление своих функций после лечения. В данном исследовании мы выявили, что у пациентов были усилены функции Т- и В-клеток, как доказательство реакции пролиферации на разные митогены. Это доказывает, что BioBran вызывает общую стимуляцию иммунитета.

Предварительные результаты настоящего исследования достаточны для проведения дальнейших клинических исследований.

Морфологически ЕК представляют собой большие гранулосодержащие лимфоциты. Характерные для них азурофильные цитоплазматические гранулы являются аналогами лизосом фагоцитирующих клеток. Однако ЕК фагоцитарной функцией не обладают. Неспеци­фический характер их цитотоксического действия отличает эти клет­ки от антигенспецифических Т-киллеров и от К-клеток, опосредую­щих антителозависимую цитотоксичность. Среди лей­коцитов крови человека ЕК составляют до15% (подробнее см.иммунокомпетентнык клетки).

Гуморальные факторы

Лизоцим

Лизоцим представляет собой термостабильный белок типа муколитического фермента. Он содержится в тканевых жидкостях животных и человека - в слезах, слюне, перитонеальной жидкости, плаз­ме и сыворотке крови, в лейкоцитах, материнском молоке и др.

Лизоцим продуцируется моноцитами крови и тканевыми мак­рофагами. Он вызывает лизис многих сапрофитных бактерий, оказы­вая менее выраженное литическое действие на ряд патогенных мик­роорганизмов и не активен в отношении вирусов.

Механизм бактериолитического действия лизоцима состоит в гид­ролизе связей в полисахаридных цепях пептидогликанового слоя клеточ­ной стенки бактерии. Это приводит к изменению ее проницаемости, сопровождающемуся диффузией клеточного содержимого в окружа­ющую среду, и гибели клеток.

Заживление ран в области слизистых оболочек, имеющих контакт с большим количеством различных микроорганизмов, в том числе и патогенных, в известной степени объясняется наличием лизоцима.

Система комплемента

Системой комплемента называют многокомпонентную само­собирающуюся систему белков сыворотки крови, которая играет важ­ную роль в поддержании гомеостаза. Она способна активироваться в процессе самосборки, т.е. последовательного присоединения к обра­зующемуся комплексу отдельных белков, которые называются компо­нентами, или фракциями комплемента. Таких фракций известно девять. Они продуцируются клетками печени, мононуклеарными фа­гоцитами и содержатся в сыворотке крови в неактивном состоянии.

Процесс активации комплемента может запускаться (иниции­роваться) двумя разными путями, получившими названия классический и альтернативный .

При активации комплемента классическим путем инициирующим фактором является комплекс антиген-антитело (им­мунный комплекс). Причем антитела только двух классов IgG и IgМ в составе иммунных комплексов могут инициировать активацию ком­племента.При присоединении С1 к ком­плексу антиген-антитело образуется фермент (С1-эстераза), под дей­ствием которого формируется энзиматически активный комплекс (С4b, С2а), называемый СЗ-конвертазой. Данный фермент расщепляет СЗ на СЗа и СЗb. При взаимодействии субфракции СЗb с С4 и С2 обра­зуется пептидаза, действующая на С5. Если инициирующий иммун­ный комплекс связан с клеточной мембраной, то самособирающийся комплекс С1, С4, С2, СЗ обеспечивает фиксацию на ней активиро­ванной фракции С5, а затем С6 и С7. Последние три компонента совместно способствуют фиксации С8 и С9. При этом два набора фракций комплемента - С5а, С6, С7, С8 и С9 - составляют мемб-раноатакующии комплекс, после присоединения которого к клеточной мембране клетка лизируется из-за необратимых повреждений струк­туры ее мембраны

Таким образом, при активации комплемента классическим путем ключевыми компонентами являются С1 и СЗ, продукт расщепления которого СЗb активирует терминальные компоненты мембраноатакующего комплекса (С5-С9).

Особенность альтернативного пути активации комплемента (ключевым компонентом является СЗ,) состоит в том, что инициация может происходить без участия комплекса антиген-антитело за счет полиса­харидов и липополисахаридов бактериального происхождения - липополисахарида (ЛПС) клеточной стенки грамотрицательных бакте­рий, поверхностных структур вирусов, иммунных комплексов, вклю­чающих IgА и IgЕ.

В альтернативном пути активации комплемента необходимо уча­стие сывороточного белка, названного пропердином, который акти­вен лишь в присутствии ионов М§ 2+.

Как видно из описанных каскадов реакций, многие компоненты комплемента при активации проявляют активность протеиназ или эстераз, работающих только внутри системы. При этом в процессе активации комплемента появляются продукты протеолиза компонен­тов С4, С2, СЗ и С5. Одни из них (фрагменты С4b, С2b, СЗb, С5b) участвуют непосредственно в самосборке и активации самой систе­мы комплемента. В отличие от них низкомолекулярные фрагменты СЗа и С5а, названные анафилатоксинами, по совокупности биологи­ческих эффектов -освобождение гистамина из тучных клеток, хе­мотаксис фагоцитов, нарушение проницаемости сосудов, сокращение гладких мышц и др. -играют существенную роль в патогенезе бо­лезней иммунных комплексов и других заболеваний, при которых резко усиливаются связывание и активация комплемента в организме.

Фракции комплемента при их активации классическим или аль­тернативным путем выполняют ряд эффекторных функций:

- мембраноатакующий комплекс опосредует цитолитическое и цитотоксическое действие специфических антител на клетки-«мишени»;

- анафилотоксины участвуют в иммунопатологических реакциях;

- компоненты комплемента изменяют физико-химические свой­ства иммунных комплексов; уменьшают степень агрегации и эффек­тивность их фагоцитоза;

- фрагмент СЗb способствует связыванию и захвату иммунных комплексов фагоцитами, опсонизируя объекты фагоцитоза;

- фрагмен­ты СЗb, С5а , обладающие свойствами хемоаттрактантов, уча­ствуют в развитии воспаления.

Белки острой фазы

В ходе развития защитных воспалительных реакций после инфицирования или повреждения, а также при онкогенезе и беремен­ности в организме начинается усиленная продукция белков острой фазы. Так назвали большую группу белков, обладающих антимикроб­ным действием, способствующих фагоцитозу, активации комплемента, формированию и ликвидации воспалительного очага. Белки ост­рой фазы продуцируются в печени при действии цитокинов, в основ­ном ИЛ-1, ФНО-а и ИЛ-6. Основную массу белков острой фазы составляют С-реактивный белок и сывороточные амилоиды А и Р. Другие группы белков острой фазы составляют факторы свертыва­ния крови, металлосвязывающие белки, ингибиторы протеаз, компо­ненты комплемента и некоторые другие. При воспалении содержание в крови большинства белков многократно возрастает, и определение С-реактивного белка входит в число общепринятых методов диагно­стики воспалительных процессов.

С-реактивный белок получил название вследствие способности присоединять и преципитировать С-полисахарид. Далее было установлено, что С-реактивный белок (СРБ) присоединя­ется к фосфатидилхолину - компоненту клеточной мембраны лю­бых клеток. Он способен присоединяться к микроорганизмам, акти­вированным лимфоцитам, поврежденным клеткам разных тканей, активируя при этом комплемент. Присоединяясь к нейтрофильным фа­гоцитам, СРБ усиливает фагоцитоз и элиминацию объектов фагоци­тоза. Вместе с этим СРБ подавляет продукцию супероксида и осво­бождение из гранул фагоцитов ферментов, защищая тем самым ткани от повреждения.

Сывороточный амилоид Р близок по структуре к СРБ, обладает способностью к активации комплемента.

Сывороточный амилоид А - липопротеин, обладающий способ­ностью к хематтракции нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов. По­вышенный уровень этого белка в крови наблюдается при туберкулезе и ревматоидном артрите.

К факторам свертывания крови относятся фибриноген и фактор фон Виллебранда, способствующие образованию сгустков в сосудах зоны воспаления.

Другую группу белков острой фазы составляют белки, связываю­щие железо - гаптоглобин, гемопексин, трансферрин - и тем са­мым препятствующие размножению микроорганизмов, нуждающих­ся в этом элементе.

Уровень ингибиторов протеаз в крови возрастает при воспалении в 2-3 раза. Антитрипсин, антихимотрипсин и макроглобулин препят­ствуют разрушению тканей протеазами нейтрофилов в очагах воспа­ления.

Цитокины

Медиаторы межклеточных взаимодействий, именуемые цитокинами , определяют как реакции врожденного и приобретенного иммунитета, так и ряд других жизненно необходимых функций орга­низма, значение которых выходит за рамки иммунологии.

Цитокинами называют гормоноподобные медиаторы , продуци­руемые разными клетками организма и способные повлиять на функции других или этих же групп клеток. Цитокины - пептиды или гликопротеиды, действующие как аутокринные, паракринные или межсистемные сигналы. Цитокины формируются как активи­рованными или поврежденными клетками, так и клетками без до­полнительной стимуляции. Регуляторами продукции цитокинов мо­гут быть другие цитокины, гормоны, простагландины, антигены и многие другие агенты, воздействующие на клетку. Некоторые зако­номерности цитокиновой регуляции могут быть сформулированы следующим образом:

· Каждая клетка продуцирует разные цитокины.

· Каждый цитокин может быть продуктом разных видов клеток.

· Один цитокин обладает разными эффектами действия.

· Цитокин может стимулировать или подавлять активность клетки-«мишени».

· Каждая клетка имеет рецепторы к разным цитокинам и, следо­вательно, может подвергаться одновременному или разновременному воздействию нескольких цитокинов.

· Взаимодействие нескольких цитокинов на клетку может быть синергичным или антагонистичным.

· Рецепторы цитокинов могут отделяться от клетки и взаимодей­ствовать с цитокинами вне клетки. В этих условиях свободные ре­цепторы связывают соответствующие цитокины, что препятствует их контакту с клеточными рецепторами.

· Цитокины, их рецепторы на клетках и во внеклеточных средах составляют сложную функциональную сеть, результат действия кото­рой зависит от взаимодействия этих факторов между собой и други­ми цитокинами.

· Цитокины действуют в низких концентрациях порядка 0,001 мкг/мл. Для воздействия на клетку достаточно, чтобы цитокин свя­зался с 10% клеточных рецепторов к нему.

Цитокины составляют обширный класс медиаторов различного происхождения, обладающих разными свойствами. Их классифика­ция носит условный характер, так как многие их них обладают одно­временно несколькими свойствами и могут быть отнесены к разным группам. Цитокины объединены в группы в зависимости от их про­исхождения (лимфокины, монокины), от характера эффекта (провос-палительные, противовоспалительные). Цитокины, регулирующие вза­имодействия лейкоцитов между собой и другими клетками, называ­ют интерлейкинами (ИЛ). Большинство цитокинов именуется по действию, которое было впервые обнаружено.

Группа интерлейкинов включает 17 цитокинов, большинство из которых играет ключевую роль в развитии специфического иммунно­го ответа.

Продуцируемый макрофагами и моноцитами ИЛ-1 обуславливает проли­ферацию лимфоцитов при индукции иммунного ответа, а также активирует Т-лимфоциты, увеличивает продукцию антител. ИЛ-1 действует на нейтрофилы, способствуя хемотаксису, активации метаболизма, выходу из клеток лизоцима и лактоферрина. Этот цитокин - эндогенный пироген, вызывающий лихорадку за счет воздействия на гипоталамический центр терморегуляции.

ИЛ-2 продуцируется Т-лимфоцитами (в основном Тх1), активированны­ми антигеном, собственным ИЛ-2, другими интерлейкинами: ИЛ-1, ИЛ-6, интерфероном, фактором некроза опухоли (ФНО). Без ИЛ-2 позитивный им­мунный ответ на антиген не возникает, стимулированный антигеном лимфо­цит гибнет, что может привести к развитию толерантности к данному анти­гену. Интерлейкины ИЛ-4 и ИЛ-10 подавляют продукцию ИЛ-2. Это способ­ствует развитию эффекторов гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), формированию киллеров из СD8 + лимфоцитов, усилению действия ЕК. Все это стимулирует противоопухолевый иммунитет и позволяет рекомендовать рекомбинантный ИЛ-2 для лечения онкологических больных.

Факторы роста - большая группа гликопротеинов, контролиру­ющих пролиферацию и созревание потомков стволовой кроветвор­ной клетки. Они продуцируются разными видами клеток и действу­ют на разные этапы их развития.

Колониестимулирующие факторы (КСФ) получили свое название благодаря тому, что было обнаружено их свойство способствовать дифференцировке введенных мышам клеток костного мозга в зрелые гранулоциты и/или моноциты с образованием в селезенке животных ко­лоний соответствующих клеток. Гранулоцитарный КСФ обеспечивает дифференцировку предшественников гранулоцитов в зрелые нейтрофи-лы. Моноцитарный КСФ способствует созреванию моноцитов и мак­рофагов из клеток-предшественников, а гранулоцитарно-моноцитарный КСФ стимулирует формирование гранулоцитов и макрофагов из их общих предшественников.

Интерфероны (ИФ) были открыты как противовирусные аген­ты. Затем были обнаружены их иммунорегулирующие свойства. Су­ществует три разновидности ИФ

У здоровых людей ИФ в крови не обнаруживаются. Их уровень повышен при красной волчанке, ревматоидном артрите, склеродер­мии. Наличие интерферона в крови этих больных увеличивает рези­стентность к вирусным инфекциям и опухолям, но неблагоприятно сказывается на развитии аутоиммунных процессов, свойственных этим заболеваниям.

Препараты интерферонов используются для лечения лейкемий и некоторых других онкологических процессов. Для усиления противо­вирусной защиты используют средства, повышающие продукцию собственного интерферона (интерфероногены). В качестве индукто­ров эндогенного интерферона применяют противовирусные вакцины, препараты РНК и ДНК.

Цитотоксины. Такое название получили цитокины группы фак­торов некроза опухолей (ФНО) , который был впервые обнаружен как компонент сыворотки крови животных, стимулированных бактерий­ным токсином, вызывающий некротические процессы в опухолевой ткани. ФНО служит медиатором ответа организма на микробную инвазию. Эндотоксины (липиполисахариды) микробов стимулируют клетки-продуценты к образованию ФНО, который, в свою очередь, обеспечивает хемотаксис фагоцитов в инфицированную ткань и уси­ливает фагоцитоз возбудителей. В настоящее время известно, что ФНО составляют по крайней мере две группы (альфа и бета) медиаторов, продуцируемых активированными макрофагами, естественными кил­лерами, а также лимфоцитами, нейтрофилами и тучными клетками.

Завершая рассмотрение цитокинов и их эффектов, необходимо подчеркнуть, что в механизмах иммунитета участвуют две группы противоположно действующих цитокинов. Одна группа - провоспалительные цитокины (ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8 и другие лимфокины, ФНО-а, а также ИФ), стимулируя разные клетки и механизмы, усиливают врожденную неспецифическую защиту, воспаление, способствуют развитию специфических иммунных реакций. Вторая функциональная группа - противовоспалительные цитокины (ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-13, ТРФ) подавляет развитие как неспецифических, так и специфических иммунных реакций.

Адгезины. Среди факторов, определяющих прямые контакты клеток орга­низма между собой и с представителями микрофлоры, существенную роль играют молекулы адгезии или адгезины. Предполагается, что в эволюции живого появление молекул адгезии сделало возможным возникновение мно­гоклеточных организмов. Более 90% микробов, составляющих нормальную микрофлору человеческого организма, обитают в нем благодаря молекулам адгезии. Блокирование адгезии патогенных микроорганизмов к клеткам и тканям организма - один из основных путей антимикробной защиты. Моле­кулы адгезии экспрессируются на мембранах клеток, определяя их способ­ность контактировать с другими клетками и неклеточными субстратами. Ре­цепторами молекул адгезии в организме могут быть другие молекулы адгезии на поверхности клеток, углеводные компоненты мембран, иммуноглобулины. Количество молекул адгезии и рецепторов к ним увеличивается при антиген­ной или любой другой активации клеток.

В ходе иммунного ответа молекулы адгезии определяют контакты антиген-представляющих клеток с лимфоцитами и лимфоцитов между собой. Молеку­лы адгезии входят в состав рецепторов иммунокомпетентных клеток и опреде­ляют тропность клеток иммунной системы к определенным тканям или орга­нам - хоминг-эффект (англ. Ноте - дом).

Молекулы адгезии условно разделяют на группы: селектины, интегрины, молекулы суперсемейства иммуноглобулинов .

Селектины - семейство поверхностных молекул адгезии, определяю­щие присоединение клеток к углеводным компонентам других структур.

Интегрины - большая группа молекул, определяющая взаимодействия белок-белок.Интегрины играют роль в межклеточных контактах при воспалении, реакциях иммуните­та, аутоиммунных повреждениях тканей, процессах репарации. Интегрины экспрессируются на клетках опухолей и играют роль в процессах метастази-рования. Их определение используется для диагностики разных видов злока­чественных опухолей.

К молекулам суперсемейства иммуноглобулинов относится более 15 ва­риантов молекул, которые обозначаются заглавными латинскими буквами, соответствующими обозначению их функции: адгезии клетка-клетка или бе­лок-белок.

К молеку­лам адгезии суперсемейства иммуноглобулинов относятся СD4 + , СD8 + моле­кулы Т-лимфоцитов, определяющие их контакты со структурами МНС II или I класса и дифференцировку этих двух классов Т-клеток между собой.

Адгезины формально не относятся к системе цитокинов, но обладают мно­гими сходными с ними функциями и участвуют в межклеточной кооперации.

Белки теплового шока

При воздействии на микробные и эукариотические клетки неблагоприятных стрессовых факторов - повышенной температуры, голодания, токсинов, тяжелых металлов, вирусов, в них формируют­ся защитные белки. Они получили название белков теплового шока , так как они были впервые обнаружены при тепловом воздействии на клетки.В результате повышаются термоустойчивость и резистентность клеток за счет за­щиты и коррекции поврежденных стрессом клеточных белков

Помимо поддержания резистент­ности клеток к шоковым воздействиям БТШ принимают участие в эндоцитозе вирусных частиц, процессинге антигенов, входят в состав некоторых рецепторных комплексов (стероидные рецепторы).

Свободные рибосомы с отдельными элементами шероховатого эндоплазматического ретикулума , аппарат Гольджи и характерные электроноплотные гранулы, связанные с мембраной. Большие зернистые лимфоциты с активностью нормальных киллеров выполняют цитотоксические функции, также как и цитотоксические T- лимфоциты ( рис. 2.16 "Уничтожение инфицированных вирусом клеток. Помимо механизма действия NK показан механизм действия цитотоксических T- лимфоцитов , которые прикрепляются к мишени в результате специфического узнавания поверхностного антигена , связанного с молекулами MHC класса I ").

Основная обязанность киллерных клеток - выявлять и уничтожать собственные клетки организма, в которых что-то нарушилось: они убивают опухолевые клетки и клетки, зараженные вирусами (а также, возможно, и другими чужеродными агентами).

Нормальные киллеры (НК-клетки) у человека составляют примерно 5% лимфоцитов периферической крови. Чаще всего они имеют фенотип CD3-CD16+CD56+CD94+ и гаметное (неперестроенное) расположение генов. Таким образом, хотя НК относятся к лимфоидным клеткам, они лишены маркеров Т- и В-лимфоцитов.

Полагают, что NK узнают определенные структуры высокомолекулярных гликопротеинов, которые экспрессируются на мембране инфицированных вирусом клеток. Узнавание клетки-мишени и сближение с ней происходит за счет рецепторов NK. В результате NK активируются, и содержимое гранул выбрасывается во внеклеточное пространство. Возможно, главная роль здесь принадлежит перфорину (цитолизину), имеющему некоторое структурное сходство с компонентом комплемента C9 (антитела к перфорину подавляют внеклеточное уничтожение). Перфорин встраивается в мембрану клетки- мишени и образовывает трансмембранные поры, что приводит к гибели клетки, поскольку содержимое клетки вытекает через эти поры. Кроме того, гранулы NK содержат две сериновые протеинкиназы, которые могут функционировать как цитотоксические факторы, но не вполне ясна их роль в NK-зависимом лизисе. Хондроитинсульфат A - протеогликан, устойчивый к протеинкиназам - тоже обнаружен в NK и может защищать эти клетки от автолиза.

При распознавании мишени НК-клетки способны как к "положительному", так и к "отрицательному" распознаванию.

Одной из характеристик НК является наличие Fc-рецептора .

NK-лимфоциты играют важную роль в противовирусном и противоопухолевом иммунитете и участвуют в отторжении трансплантата. Снижение цитотоксической активности NK-лимфоцитов выявляется при многих заболеваниях, в том числе при злокачественных новообразованиях , а отсутствие наблюдается крайне редко.

Лимфоидный росток гемопоэза в костном мозге представлен В-, Т- и NK-клеточными линиями. Клетки-предшественники имеют морфологическую характеристику бластов или зрелых лимфоцитов. В костном мозге В- и Т-лимфобласты составляют очень небольшую долю клеток (менее 0,5 %), лимфоциты - 4,3-13,7 %.

В-лимфоидные предшественники в костном мозге - центральном органе В-лимфопоэза проходят антигеннезависимую стадию созревания. При этом происходит перестройка (реаранжировка) генов иммуноглобулинов, расположенных на хромосомах 2, 22 и 14. Отдельные этапы дифференцировки характеризуются появлением специфичных макромолекул, определяющих иммунофенотип клеток.

На самых ранних про-В-клетках сохраняются антигены стволовых элементов (CD34 и CD38) и появляются специфические макромолекулы пан-BCD19, а затем цитоплазматический CD22. Эти антигены характерны для всех элементов В-лимфоидного ряда. Затем на пре-В-клетках снижается содержание стволово-клеточных и появляются другие В-антигены - CD 10, CD20 и CD24. Следующий этап созревания (npe-В-бласты) характеризуется появлением в цитоплазме клеток (J-цепи Ig. На последнем этапе костномозговой В-дифференцировки на мембране лимфоидных элементов экспрессируется полная молекула (легкие и тяжелые цепи) IgM.

После этого морфологически зрелые, но иммунологически «наивные» В-лимфоциты попадают в кровь и в периферические органы иммунной системы: лимфатические узлы, селезенку и др. Там после контакта с антигеном в зародышевых центрах вторичных лимфоидных фолликулов они проходят антигензависимую стадию дифференцировки. В итоге формируется пул зрелых В-лимфоцитов и плазматических клеток, способных синтезировать и продуцировать иммуноглобулины разных классов, что позволяет им принимать участие в регуляции и осуществлении гуморального ответа иммунной системы.

Предшественники Т-клеток в костном мозге характеризуются экспрессией стволово-клеточных (CD34, HLA-Dr) и Т-антигенов (CD7, цитоплазматический CD3±). Сначала Т-предшественники мигрируют в тимус, который является центральным органом Т-лимфопоэза, а затем поступают в периферические лимфоидные органы, где проходят антигензависимую стадию дифференцировки. В вилочковой железе осуществляется перестройка генов, кодирующих Т-клеточный рецептор (TCR), и TCR появляется на поверхностной мембране. Этот рецептор совместно с белками-продуктами гена главного комплекса гистосовместимости распознает и связывает антигены. Большинство Т-лимфоцитов крови экспрессируют а- и бета-цепи TCR, в то время как Т-лимфоциты эпителия кишечника и слизистой оболочки влагалища - у-и сигма-цепи.

T-лимфоциты: этапы внутритимусной дифференцировки.

Этапы внутритимусной дифференцировки клеток от мигрировавшего в орган костномозгового предшественника (пре-Т-клеток) до зрелого T-лимфоцита, покидающего тимус, связаны с изменением экспрессии фенотипических Т-клеточных маркеров. Основными из них являются: CD4 - корецептор T-хелперов, CD8 - корецептор цитотоксических T-лимфоцитов (T-киллеров) и альфа-бета ТКР (Т-клеточный антигенраспознающий рецептор). Специфическая комбинация этих поверхностных молекул может быть использована в качестве маркеров дифференцировки клеток в тимусе.

Табл.1 Фенотипические маркеры дифференцирующихся тимоцитов

Этап	Маркеры			Тип дифференцирующихся тимоцитов
	Корецепторы Т-клеток	Т-клеточный
			двойной негатив
			двойной позитив
			двойной позитив
			одинарный позитив
			одинарный позитив

На первом этапе из плюрипотентной гемопоэтической стволовой клетки (СКК) костного мозга, обеспечивающей миело- и лимфопоэз, образуется общий для Т- и В-лимфоцитов предшественник.

Ближайшим потомком предшественником Т-лимфоцитов является протимоцит или коммитированный предшественник Т-клеток (пре-Т-кл.). Характерным маркером пре-Т-клеток костного мозга является один из антигенов мозга (АМ). Первые мигрирующие в субкасулярную область тимуса пре-Т-клетки теряют АМ, но приобретают типичный маркер тимоцитов и периферических Т-клеток - Thy-1. Тимоциты субкапсулярной зоны являются в основном двойными негативами и не экспрессируют Т-клеточный рецептор (ТКР). Фенотип таких клеток СD4-CD8-альфа-бета-ТКР-.

Постепенно по мере перемещения в корковый слой тимоциты начинают экспрессию как CD4, так и CD8 корецепторов, а также ТКР. Медуллярная зона тимуса - место локализации бластных форм с фенотипом, характерным для самостоятельных субпопуляций Т-клеток (CD4+CD8-альфа-бета-ТКР+ - Т-хелперы/индукторы; CD4-CD8+альфа-бета-ТКР+).

Отсюда и их название " двойные негативы ". Они заселяют верхнюю часть коры тимуса, расположенную непосредственно под капсулой органа - субкапсулярную область. В полностью развитом тимусе двойные негативные клетки составляют незначительный, всего около 5% от общего числа тимоцитов клеточный пул.

Зрелые Т-лимфоциты присутствуют в периферической крови, в тимусзависимых областях селезенки, лимфатических узлов, миндалин, пейеровых бляшек. В периферической крови Т-лимфоцитарный пул представлен двумя фракциями - хелперами/эффекторами (CD4+) и супрессорами/цитотоксическими клетками (CD8+). Т-лимфоциты CD4+ разделяются на два субтипа: Т-хелперы-1 (Тh1) и Т-хелперы-2 (Th2). Клетки первого типа способны усиливать синтез и продукцию клетками Ig, клетки второго типа - индуцировать антигенспецифическую активность Т-супрессоров.

Т-лимфоидные клетки не синтезируют и не секретируют иммуноглобулины. Они обладают способностью производить белки и гормоны (цитокины), которые регулируют пролиферацию и дифференцировку других клеток, принимают участке в клеточном иммунном ответе.

Естественные (натуральные) киллеры (NK-клетки) имеют независимую линию дифференцировки. В периферической крови они морфологически характеризуются как большие гранулированные лимфоциты с ядром с небольшой выемкой и большими азурофильными гранулами. Их фенотип CD3-, CD16+, CD56+. Они не имеют перестройки TCR, экспрессируют на мембране рецептор к CR2 (CМ). вирусу Эпштейна-Барр, Fc-рецептор - для IgG. NK-клетки способны отвечать за спонтанную клеточную цитотоксичность.