Гибкость метода
Минимальный	Очень маленький	Очень маленький		Небольшой
размер образца
Максимальный	Небольшой	Небольшой	Нет ограничений
размер образца
Стоимость		Умеренная	Умеренная
Тип препарата	Нерастворенный или не способный		Растворенный или	Только частички
	раствориться		способный
			раствориться

1) Обозначение звездочками - чем больше звездочек, тем большее преимущество имеет метод.

8. Благодарности

Данная глава была написана, когда автор работал в качестве приглашенного профессора в отделе молекулярной и клеточной биологии в Университете Коннектикута, Коннектикут, США. Я хотел бы поблагодарить сотрудников отдела, в частности д-ра Эмори Брэсуелла (Emory Braswell), за их гостеприимство, а также сотрудников университетской библиотеки имени Уилбара Кросса за их помощь. Я благодарен также Университету Шеффилда за разрешение на финансирование моих исследований.

9. Указанные в тексте работы и литература для дальнейшего чтения

Теоретические основы

1. Baker, I. R. (1958) Principles of Biological Microtechnique: A Study of Fixation and Dyeing, Methuen, London.

2. Horobin, R. W. (1988) Understanding Histochemistry: Selection, Evaluation and Design of Biological Stains. Ellis Horwood, Ghichester.

Источники технической информации (табл. 5.20)

3. Bancroft, J. D. and Stevens, A. (1989) Theory and Practice of Histological Techniques, Churchill Livingstone, Edinburgh, 3nd edn.

4. Lillie, R. D. and Fullmer, H. M. (1976) Histopathologic Technic and Practical Histochemistry, McGraw-Hill, New York, 4-е изд.

5. Thompson, S. W. and Luna, L. (1978) An Atlas of Artifacts Encountered in the Preparation of Microscopic Tissue Sections. Thomas Springfield, IL.

6 Pearse, A. G. E. (1968, 1972, 1988) Histochemistry, Theoretical and Applied. Vol. 1, Chirchill, London, Vol. 2, Chirchill, Livingstone, Edinburh, and Vol 3 (Имеется перевод: Пирс А. Г. Гистохимия, М. Мир, 1962).

7. Clark, G. (1981) Staining Procedures. Williams and Wilkins, Baltimore, MD, 4th edn.

8. Gahan, P. B. (1984) Plant Histochemistry and Cytochemistry: an Introduction. Academic Press, New York.

9. Jensen, W. A. (1962) Botanical Histochemistry, Principles and Practice. Freeman, San Francisco, CA.

10. Thompson, S. W. (1966) Selected Histochemical and Histopathological Methods. Thomas, Springfield, IL.

11. Adams, C. W. M. (1965) Neurohistochemistry. Elsevier, Amsterdam.

Литература по очистке реагентов и их номенклатуре

12. Horobin, R. W. (1969) Histochem. J., 1, 115.

13. Lillie, R. D. (1977) Conn"s Biological Stains. Williams and Wilkms, Baltimore, MD, 9th edn.

ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ

Иохан С. Плоэм

1. Введение

В основе флуоресцентной микроскопии лежит способность некоторых веществ поглощать свет определенной части спектра, энергия которого затем частично выделяется в виде света. Испускаемый свет отличается от поглощенного света длиной волны и интенсивностью. В соответствии с правилом Стокса длина волны испускаемого света больше, чем длина волны поглощаемого света, и эта разность длин волн лежит в основе наблюдения флуоресценции при флуоресцентной микроскопии. Интенсивность испускаемого света меньше, чем интенсивность возбуждающего света, так как количество выделяемой энергии во много раз

Поглощение и дальнейшее переизлучение света неорганическими и органическими средами является результатом фосфоресценции или флуоресценции. Разница между феноменами состоит в продолжительности интервала между световым поглощением и испусканием потока. При флуоресценции эти процессы происходят практически одновременно, а при фосфоресценции - с некоторым опозданием.

Историческая справка

В 1852 г. британский ученый Стокс впервые описал флуоресценцию. Он ввел новый термин в результате выполненных экспериментов с который испускал красный свет под воздействием ультрафиолета. Стокс отметил интересное явление. Он выявил, что длина волны при флуоресцентном излучении всегда больше, чем у потока света возбуждения.

Для подтверждения гипотезы в 19-м столетии было проведено множество экспериментов. Они показали, что разнообразные образцы флуоресцируют под действием ультрафиолета. Среди материалов, в числе прочего, были кристаллы, смолы, минералы, хлорофилл, лекарственное сырье, неорганические соединения, витамины, масла. Непосредственное же применение красителей для проведения биологических анализов началось только в 1930 г.

Флуоресцентная микроскопия: описание

Некоторые из материалов, использованных в исследованиях первой половины 20-го столетия, обладали высокой специфичностью. Благодаря показателям, которые не могли быть достигнуты контрастными способами, стал важнейшим инструментом и в биомедицинских, и в биологических исследованиях. Немаловажное значение полученные результаты имели и для материаловедения.

Какие преимущества имеет метод флуоресцентной микроскопии ? С помощью новых материалов стало возможным выделение высокоспецифичных клеток и субмикроскопических компонентов. Флуоресцентный микроскоп позволяет обнаружить отдельные молекулы. Разнообразные красители позволяют идентифицировать несколько элементов одновременно. Несмотря на ограниченность пространственного разрешения оборудования дифракционным пределом, который, в свою очередь, зависит от специфических свойств образца, выявление молекул ниже этого уровня также вполне возможно. Различные образцы после облучения проявляют автофлуоресценцию. Это явление достаточно широко применяется в петрологии, ботанике, полупроводниковой промышленности.

Особенности

Изучение животных тканей либо патогенных микроорганизмов зачастую осложняется или слишком слабой, или очень сильной неспецифичной автофлуоресценцией. Однако значение в исследованиях приобретает внесение в материал компонентов, возбуждаемых на конкретной длине волны и испускающих световой поток необходимой интенсивности. Флуорохромы выступают в качестве красителей, способных самостоятельно прикрепляться к структурам (невидимым или видимым). При этом они отличаются высокой избирательностью относительно мишеней и квантовым выходом.

Флуоресцентная микроскопия стала широко применяться с появлением естественных и синтетических красителей. Они обладали определенными профилями интенсивности испускания и возбуждения и были нацелены на конкретные биологические мишени.

Выявление отдельных молекул

Часто в идеальных условиях можно зарегистрировать свечение отдельного элемента. Для этого, кроме прочего, нужно обеспечить достаточно низкий шум детектора и оптический фон. Молекула флуоресцеина до разрушения вследствие фотообесцвечивания может испускать до 300 тыс. фотонов. При 20 % собираемости и эффективности процесса их можно зарегистрировать в количестве порядка 60 тыс.

Флуоресцентная микроскопия , основанная на лавинных фотодиодах или электронном умножении, позволяла исследователям наблюдать поведение отдельных молекул на протяжении секунд, а в ряде случаев и минут.

Сложности

Ключевой проблемой выступает подавление шума от оптического фона. В связи с тем, что многие из материалов, используемых в конструкции фильтров и линз, проявляют некоторую автофлуоресценцию, усилия ученых на начальных этапах были ориентированы на выпуск компонентов, обладающих малой флуоресценцией. Однако последующие эксперименты привели к новым выводам. В частности, было установлено, что , основанная на полном внутреннем отражении, позволяет достичь низкого фона и высокоинтенсивного возбуждающего светового потока.

Механизм

Принципы флуоресцентной микроскопии , основанной на полном внутреннем отражении, заключаются в использовании быстрозатухающей или нераспространяющейся волны. Она возникает на границе сред с различными В данном случае световой пучок проходит сквозь призму. Она обладает высоким параметром преломления.

Призма прилегает к водному раствору или стеклу с низким параметром. Если поток света направляется на нее под углом, который больше критического, пучок полностью отражается от границы раздела. Это явление, в свою очередь, вызывает нераспространяющуюся волну. Другими словами, генерируется электромагнитное поле, проникающее в среду с меньшим параметром преломления на расстояние меньше 200 нанометров.

В нераспространяющейся волне будет вполне достаточной для возбуждения флуорофоров. Однако вследствие ее исключительно незначительной глубины его объем будет очень малым. В результате возникает низкоуровневый фон.

Модификация

Флуоресцентная микроскопия, основанная на полном внутреннем отражении, может реализовываться с помощью эпи-освещения. Для этого необходимы объективы с повышенной числовой апертурой (как минимум 1.4, однако желательно, чтобы она достигала 1.45-1.6), а также частично освещенное поле аппарата. Последнее достигается с помощью пятна небольшого размера. Для большей равномерности используется тонкое кольцо, посредством которого блокируется часть потока. Для получения критического угла, после которого возникает полное отражение, нужен высокий уровень преломления иммерсионной среды в линзах и покровного стекла микроскопа.

, двухфотонная микроскопия , флуоресцентная наноскопия Определение метод детектирования флуоресцентных микрообъектов с помощью светового микроскопа. Широко применяется в материаловедении и медико-биологических областях. Описание

Биологический материал, как правило, сам по себе флуоресцирует крайне слабо, но благодаря применению ярких и разнообразных флуоресцентных молекул (флуорофоров), способных специфически окрашивать разные структуры тканей и клеток метод флуоресцентной микроскопии оказался очень ценным для медико-биологических наук.

Традиционные методы флуоресцентной микроскопии обладают существенно более низким разрешением по сравнению с электронной или атомно-силовой микроскопией . Однако в отличие от последних, оптическая микроскопия позволяет наблюдать за внутренней микроструктурой клеток и даже небольших организмов, причём не только фиксированных, но и живых. Благодаря этому флуоресцентная микроскопия оказалась наилучшим методом для изучения механизмов функционирования организмов на клеточном, субклеточном и молекулярном уровнях.

Флуоресцентный микроскоп состоит из источника света, возбуждающего флуорофор; детектора, регистрирующего излучение флуорофора; и оптической системы, которая обеспечивает фокусировку света и увеличение объекта . Согласно классическим работам Э. Аббе, разрешение оптической системы, построенной на использовании линз, ограничено свойством дифракции света . Предельная дистанция, на которой могут быть различены два объекта (d ), определяется длиной волны света ?, угловой апертурой объектива a и показателем преломления среды n : d = ?/ (2n * sina) . Поскольку обычно n < 1.56, a < 70 o а длина волны используемого излучения находится в диапазоне 350-600 нм, то лучшее разрешение традиционных микроскопов составляет более 200 нм в фокусной плоскости и более 450 нм вдоль оптической оси.

Интенсивное развитие флуоресцентной микроскопии на рубеже XX-ого и ХХI-ого веков привело к развитию новых методов – двухфотонной и конфокальной микроскопии , а также ряда подходов, позволивших преодолеть дифракционный барьер оптического разрешения и достичь беспрецедентного нано-разрешения (флуоресцентная наноскопия).

• Борисенко Григорий Геннадиевич, к.б.н.

Ссылки

1. K?ssens M., Wegerhoff R. and Weidlich O. Basics of Light microscopy. - Wiley, GIT VERLAG GmbH & Co. KG,
2. http://www.microscopyu.com/
3. Abbe, E. Beitr?ge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Arch. Mikr. Anat. 9, 413–468 (1873).

Иллюстрации Теги Разделы Получение, диагностика и сертификация наноразмерных систем

Энциклопедический словарь нанотехнологий. - Роснано . 2010 .

Смотреть что такое "флуоресцентная микроскопия" в других словарях:

Флуоресцентная микроскопия. См. люминисцентная микроскопия. (Источник: «Англо русский толковый словарь генетических терминов». Арефьев В.А., Лисовенко Л.А., Москва: Изд во ВНИРО, 1995 г.) … Молекулярная биология и генетика. Толковый словарь.

То же, что Люминесцентная микроскопия. См. также Микроскоп [метод исследования в свете люминесценции (люминесцентная микроскопия, или флуоресцентная микроскопия)] и Люминесцентный анализ … Большая советская энциклопедия

Схематическое изображение принципа действия флуоресцентного микроскопа Флуоресцентная микроскопия метод получения увеличенного изображения с использ … Википедия

флуоресцентная микроскопия - fluorescencinė mikroskopija statusas T sritis fizika atitikmenys: angl. fluorescence microscopy vok. Fluoreszenzmikroskopie, f rus. флуоресцентная микроскопия, f pranc. microscopie à fluorescence, f … Fizikos terminų žodynas

ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ - микроскопия, основанная на способности многих веществ светиться при ультрафиолетовом облучении. Дает возможность изучать изменения клеток и их отдельных структур при различных функциональных состояниях, различать живые и мертвые клетки … Словарь ботанических терминов

Термин флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения Термин на английском total internal reflection fluorescence microscopy Синонимы Аббревиатуры TIRFM Связанные термины клетка, флуоресцентная микроскопия, флуоресцентная наноскопия… …

Люминесцентная (флуоресцентная) микроскопия - метод наблюдения под микроскопом люминесцентного свечения микрообъектов при освещении их сине фиолетовым светом или ультрафиолетовыми лучами. Возбуждение люминесценции микроскопических объектов, окрашенных флуорохромами, производится… … Официальная терминология

Термин флуоресцентная наноскопия Термин на английском fluorescence nanoscopy Синонимы Аббревиатуры TIRFM, 4Pi, I5M, I5S, STED, GSD, SPEM (SSIM), RESOLFT, PALM, STORM, PAINT Связанные термины конфокальная микроскопия, флуоресцентная микроскопия… … Энциклопедический словарь нанотехнологий

флуоресцентная (люминисцентная) микроскопия - Высокочувствительный микроскопический метод (анализ проводится как в отраженном, так и в проходящем свете), основанный на обработке тестируемого материала красителями флуорохромами, флуоресцирующие (окрашенные) зоны выглядят при Ф.м. как яркие… … Справочник технического переводчика

Общее название методов наблюдения в микроскоп неразличимых человеческим глазом объектов. Подробнее см. в ст. (см. МИКРОСКОП). Физический энциклопедический словарь. М.: Советская энциклопедия. Главный редактор А. М. Прохоров. 1983 … Физическая энциклопедия

Книги

• Оптическая биомедицинская диагностика. В 2-х томах. Том 1. Гриф МО РФ , Под редакцией В. В. Тучина. Коллективная монография написана ведущими специалистами в области оптической биомедицинской диагностики, хорошо известна в американских и европейских университетах и используется там как…

Чтобы понять, что же такое флуоресцентная микроскопия и принцип проведения исследований с ее помощью, нужно разобраться, как работают люминесцентные микроскопы.

Люминесцентные микроскопы работают, используя возможности естественного свечения клеток биологических организмов. Такие микроскопы способны заставить светится исследуемый объект посредством совместной работы двух светофильтров: возбуждающего и запирающего.

Возбуждающий светофильтр провоцирует свечение исследуемого объекта, а запирающий, в свою очередь, блокирует возбуждающий, оставляя только естественное или же люминесцентное свечение определенной исследуемой клетки.

Итак, можем сделать вывод, что флуоресцентная микроскопия — это исследование структуры клеток, на основе использования их естественного (природного) свечения.

Первый люминесцентный микроскоп был создан в 1911 году . Возможность его использования была доказана ученым А. Келлером. Известно также, что впервые использовал данное изобретение для проведения научных исследований русский ученый М. Цвет, который показал миру флуоресцентные возможности свечения хлорофилла в клетках растений.

В наше время люминесцентные микроскопы активно используются в таких научных сферах, как:

• микробиология;
• вирусология;
• гематология;
• цитодиагностика;
• цитогенетика.

В медицине флуоресцентная микроскопия используется для исследований разного рода грибковых заболеваний, к которым относится кандидоз, вызванный грибами CandidaAlbicans.

Как уже говорилось выше, флуоресцентная микроскопия активно используется в медицине, в частности, в гинекологии . Люминесцентные микроскопы способны с высокой точностью выявить вредоносные колонии грибков, которые доставляют пациенткам немало дискомфорта.

Люминесценцию также используют, чтобы обнаружить:

• кислотоустойчивые микобактерии;
• возбудителей и .

Исследовать такие образцы, как, к примеру, витамины А и В2, а также хлорофилл стоит как можно быстрее, поскольку от влияния на них УФ-излучением, они могут потерять свои люминесцентные способности.

Пожалуй, единственным минусом флуоресцентной микроскопии является покупка самого оборудования для исследований, а также высокая стоимость расходных материалов . Кроме того, чтобы проводить исследования на люминесцентном оборудовании необходимо дополнительное обучение сотрудников лаборатории.

Лампы на флуоресцентном микроскопе очень чувствительны, быстро изнашиваются, их следует регулярно осматривать на предмет поломок и заменять. Малейшее колебание напряжения электричества может вывести такой микроскоп из строя.