Иммунологические реакции в диагностике инфекционных заболеваний. Клеточные основы иммунологических реакций Постановка реакции хеддльсона при бруцеллезе

Способность организма противостоять внешним воздействиям и сохранять при этом постоянство внутренней среды связана как с функционированием механизмов неспецифической защиты, так и с возможностью развивать высокоспециализированную форму реакции - иммунный ответ. Иммунная система играет важную роль в сложном механизме адаптации человеческого организма, обеспечивая сохранение антигенного гомеостаза, нарушение которого может быть обусловлено проникновением в организм чужеродных антигенов или спонтанной мутацией. Механизмы, направленные на элиминацию чужеродного агента, чрезвычайно разнообразны. При этом можно выделить два понятия: «неспецифические факторы защиты» и «иммунологическая реактивность».

Под неспецифической резистентностью понимают способность организма противостоять действию чужеродных агентов выработанными в процессе эволюции стереотипными механизмами. Они первыми защищают организм, давая ему время на формирование полноценного иммунного ответа. Защищенность организма от инфекций зависит от степени проницаемости для патогенных микроорганизмов кожи и слизистых, наличия в их секретах бактерицидных субстанций, кислотности желудочного содержимого. Механизмы неспецифической резистентности разделяют на клеточные и гуморальные. Клеточные реакции представлены фагоцитозом, который осуществляют, в основном, нейтрофилы и макрофаги.

К гуморальным факторам относятся система комплемента, лизоцим, белки острой фазы воспаления, интерфероны и др. Все эти механизмы относятся к неспецифическим факторам защиты потому, что существуют вне зависимости от присутствия или отсутствия возбудителя. Однако несмотря на неспецифичность фагоцитоза, макрофаги участвуют в переработке антигена (АГ), в кооперации Т- и В-лимфоцитов при иммунном ответе, т. е. в специфических формах реагирования на чужеродные субстанции.

Аналогично выработка комплемента не является специфической реакцией на антиген, но классический путь активации системы комплемента инициируется комплексом антиген–антитело.

Иммунологическая реактивность - это способность организма отвечать на действие антигена специфическими по отношению к нему клеточными и гуморальными реакциями. Эта способность обусловлена существованием двух видов иммунных клеток: Т-лимфоцитов, которые непосредственно реагируют с антигеном и осуществляют клеточные иммунные реакции, и В-лимфоцитов, превращающихся под действием антигена в плазматические клетки, которые вырабатывают иммуноглобулины, ответственные за гуморальные иммунные реакции. Т- и В-лимфоциты несут на своей поверхности специфические рецепторы для распознавания антигенов.

При поступлении антигенных веществ в организм осуществляется:

презентация и распознавание антигена;

размножение Т- и В-лимфоцитов клона, несущего рецепторы или продуцирующего антитела против этого антигена, заканчивающееся образованием субпопуляций лимфоцитов и антител;

специфическое взаимодействие субпопуляций Т-лимфоцитов и антител с антигеном;

образование комплексов антиген–антитело с участием лейкоцитов крови, биологически активных веществ, ускоряющих инактивацию антигена в организме;

формирование иммунной памяти;

предупреждение и угнетение выработки антител против компонентов собственного организма, т. е. индукция и поддержание иммунной толерантности к своим антигенам.

Клеточный иммунный ответ. Т-лимфоциты различаются по наличию маркерных антигенов (сейчас насчитывают уже более 10 типов Т-клеток). По способности к взаимодействиям с антигеном и другими лимфоцитами выделяют основные субпопуляции Т-лимфоцитов:

Т-хелперы, помогающие другим Т- и В-лимфоцитам реагировать на антиген (выделяют нескольких типов: Тх1, Тх2, Тх3, Тх17);

Т-регуляторы (супрессоры), тормозящие реакцию других лимфоцитов;

Т-киллеры, индуцирующие апоптоз в клетках-мишенях путем выделения цитотоксических лимфокинов, экспрессии на поверхности рецепторов «смерти» или выработки перфоринов (гранзимов).

Гуморальный иммунный ответ . В антигензависимый период В-лимфоциты крови и периферических органов иммунной системы стимулируются антигеном и оседают в В-зонах селезенки и лимфатических узлов (в фолликулах и центрах размножения), где претерпевают бласттрансформацию: из малых лимфоцитов превращаются в большие размножающиеся клетки, а затем в плазматические. В плазмоцитах происходит синтез иммуноглобулинов, которые поступают в кровь. У человека образуется пять классов антител (иммуноглобулинов): IgD, IgM, IgG, IgA, IgE.

Специфичность взаимодействия с антигеном достигается соответствием активного центра антитела детерминанте антигена. Благодаря совокупности механизмов, обеспечивающих мутацию и разнообразие вариабельных участков, их рекомбинацию, организм реагирует на огромное количество

разнообразных антигенов.

Высокая степень ответа на антиген обусловлена одновременным развитием клеточных и гуморальных иммунных реакций различных типов, а также поликлональностью иммунного ответа на конкретный антиген. Этот эффект объясняется кооперацией макрофагов, Т- и В-лимфоцитов,

размножением клеток клонов при стимуляции антигеном. Развитие эффективного иммунного ответа возможно только в кооперации с клетками микроокружения: эндотелием сосудов, клетками стромы (дендритные, тучные клетки, фибробласты, макрофаги и т. д.), которые формируют цитокиновый фон и участвуют в формировании очага воспаления. В качестве медиаторов кооперации при иммуногенезе вырабатываются интерфероны α, β, γ, фактор некроза опухолей (ФНО), хемокины, интерлейкины, а также колониестимулирующие факторы и факторы роста эпидермиса, гранулоцитов, макрофагов, сосудов, нервов.

Эффективность разрушения антигенов, ассоциированных с клетками, в процессе иммунных реакций обусловлена факторами, способными убивать соответствующие клетки. Реакции киллинга включают: индукцию апоптоза клеток-мишеней Т-киллерами, продукцию цитотоксических цитокинов, антителозависимую клеточную цитотоксичность, комплементзависимую цитотоксичность.

По отношению к потенциальным антигенам своего организма развивается иммунная толерантность (специфическая переносимость, ареактивность). Она формируется в течение всей жизни. При этом в результате мутаций генов в организме образуются новые клоны Т- и В-лимфоцитов, в т. ч. и те, которые способны реагировать со своими антигенами. В вилочковой железе такие клоны Т-лимфоцитов элиминируются. Запретные клоны В-лимфоцитов, нетолерантные к антигенам своего организма, или тормозятся по типу высокодозовой толерантности, или остаются незаторможенными. Оказалось, что у здоровых людей часть В-лимфоцитов не толерантна к антигенам своего организма. Однако аутоиммунный процесс при этом не возникает, т. к. без Т-хелперов В-лимфоциты не стимулируются антигеном.

Реакции антигенов с антителами называются серологическими или гуморальными, потому что участвующие в них специфические антитела всегда находятся в сыворотке крови.

Реакции между антителами и антигенами, которые происходят в живом организме, могут быть воспроизведены в лабораторных условиях с диагностической целью.

Серологические реакции иммунитета вошли в практику диагностики инфекционных болезней в конце XIX – начале ХХ века.

Использование реакций иммунитета с диагностической целью основано на специфичности взаимодействия антигена с антителом.

Определение антигенной структуры микробов и их токсинов позволило разработать не только диагностикумы и лечебные сыворотки, но и сыворотки диагностические. Иммунные диагностические сыворотки получают путем иммунизации животных (например, кроликов). Эти сыворотки используют для идентификации микробов или экзотоксинов по антигенной структуре при помощи постановки серологических реакций (агглютинации, преципитации, связывания комплемента, пассивной гемагглютинации и др.). Иммунные диагностические сыворотки, обработанные флюорохромом, используются для экспресс – диагностики инфекционных заболеваний методом иммунной флюоресценции.

С помощью известных антигенов (диагностикумов) можно определять наличие антител в сыворотке крови больного или обследуемого (серологическая диагностика инфекционных заболеваний).

Наличие же специфических иммунных сывороток (диагностических) позволяет установить видовую, типовую принадлежность микроорганизма (серологическая идентификация микроба по антигенной структуре).

Внешнее проявление результатов серологических реакций зависит от условий ее постановки и физиологического состояния антигена.

Корпускулярные антигены дают феномен агглютинации, лизиса, связывания комплемента, иммобилизации.

Растворимые антигены дают феномен преципитации, нейтрализации.

В лабораторной практике с диагностической целью используют реакции агглютинации, преципитации, нейтрализации, связывания комплемента, торможения гемагглютинации и др.

Реакция агглютинации (РА)

Благодаря своей специфичности, простоте постановки и демонстративности, реакция агглютинации получила широкое распространение в микробиологической практике для диагностики многих инфекционных заболеваний: брюшного тифа и паратифов (реакция Видаля), сыпного тифа (реакция Вейгля) и др.

Реакция агглютинации основана на специфичности взаимодействия антител (агглютининов) с целыми микробными или другими клетками (агглютиногенами). В результате такого взаимодействия образуются частицы – агломераты, выпадающие в осадок (агглютинат).

В реакции агглютинации могут участвовать как живые, так и убитые бактерии, спирохеты, грибы, простейшие, риккетсии, а также эритроциты и другие клетки.

Реакция протекает в две фазы: первая (невидимая) – специфическая, соединение антигена и антител, вторая (видимая) – неспецифическая, склеивание антигенов, т.е. образование агглютината.

Агглютинат образуется при соединении одного активного центра двухвалентного антитела с детерминантной группой антигена.

Реакция агглютинации, как и любая серологическая реакция, протекает в присутствии электролитов.

Внешне проявление положительной реакции агглютинации имеет двоякий характер. У безжгутиковых микробов, имеющих только соматический О- антиген, происходит склеивание непосредственно самих микробных клеток. Такая агглютинация называется мелкозернистой. Он происходит в течение 18 – 22 часов.

У жгутиковых микробов имеются два антигена – соматический О- антиген и жгутиковый Н- антиген. Если клетки склеиваются жгутиками, образуются крупные рыхлые хлопья и такая реакция агглютинации называется крупнозернистой. Она наступает в течение 2 – 4 часов.

Реакцию агглютинации можно ставить как с целью качественного и количественного определения специфических антител в сыворотке крови больного, так и с целью определения видовой принадлежности выделенного возбудителя.

Реакцию агглютинации можно ставить как в развернутом варианте, позволяющем работать с сывороткой разведенной до диагностического титра, так и в варианте постановки ориентировочной реакции, позволяющем в принципе обнаружить специфические антитела или определить видовую принадлежность возбудителя.

При постановке развернутой реакции агглютинации, с целью выявления в сыворотке крови обследуемого специфических антител, исследуемую сыворотку берут в разведении 1:50 или 1:100. Это обусловлено тем, что в цельной или мало разведенной сыворотке могут находиться нормальные антитела в очень высокой концентрации, и тогда результаты реакции могут быть неточными. Исследуемым материалом при этом варианте постановки реакции является кровь больного. Кровь берут натощак или не ранее чем через 6 часов после еды (в противном случае в сыворотке крови могут быть капельки жира, делающие ее мутной и непригодной для исследования). Сыворотку крови больного обычно получают на второй неделе заболевания, набирая стерильно из локтевой вены 3 – 4 мл крови (к этому времени концентрируется максимальное количество специфических антител). В качестве известного антигена используется диагностикум, приготовленный из убитых, но не разрушенных микробных клеток конкретного вида с конкретной антигенной структурой.

При постановке развернутой реакции агглютинации с целью определения видовой, типовой принадлежности возбудителя, антигеном является живой возбудитель, выделенный из исследуемого материала. Известными являются антитела, содержащиеся в иммунной диагностической сыворотке.

Иммунную диагностическую сыворотку получают из крови вакцинированного кролика. Определив титр (максимальное разведение, в котором обнаруживаются антитела), диагностическую сыворотку разливают по ампулам с добавлением консерванта. Эту сыворотку и используют для идентификации по антигенной структуре выделенного возбудителя.

При постановке ориентировочной реакции агглютинации на предметном стекле используют сыворотки с большей концентрацией антител (в разведениях не более чем 1:10 или 1:20).

Пастеровской пипеткой наносят на стекло по одной капле физиологического раствора и сыворотки. Затем к каждой капле добавляют петлей небольшое количество микробов и тщательно размешивают до получения гомогенной взвеси. Через несколько минут при положительной реакции в капле с сывороткой появляется заметное скучиванье микробов (зернистость), в контрольной капле остается равномерное помутнение.

Ориентировочной реакцией агглютинации чаще всего пользуются для определения видовой принадлежности микробов, выделенных из исследуемого материал. Полученный результат позволяет ориентировочно ускорить постановку диагноза заболевания. Если реакция плохо видна невооруженным глазом, ее можно наблюдать под микроскопом. В этом случае ее называют микроагглютинацией.

Ориентировочная реакция агглютинации, которая ставится с каплей крови больного и известным антигеном, называется кроваво – капельной.

Реакция непрямой или пассивной гемагглютинации (РПГА)

Эта реакция по чувствительности превосходит реакцию агглютинации и ее используют при диагностике инфекций, вызванных бактериями, риккетсиями, простейшими и другими микроорганизмами.

РПГА позволяет обнаружить небольшую концентрацию антител.

В этой реакции участвуют таннизированные бараньи эритроциты или эритроциты человека с кровью I группы, сенсибилизированные антигенами или антителами.

Если в исследуемой сыворотке определяются антитела, то используются эритроциты, сенсибилизированные антигенами (эритроцитарный диагностикум).

В некоторых случаях, при необходимости определения различных антигенов в исследуемом материале, используют эритроциты, сенсибилизированные иммунными глобулинами.

Результаты РПГА учитывают по характеру осадка эритроцитов.

Положительным считают результат реакции, при котором эритроциты равномерно покрывают все дно пробирки (перевернутый зонтик).

При отрицательной реакции эритроциты в виде маленького диска (пуговка) располагаются в центре дна пробирки.

Реакция преципитации (РП)

В отличие от реакции агглютинации антигеном для реакции преципитации (преципитиногеном) служат растворимые соединения, величина частичек которых приближается к размерам молекул.

Это могут быть белки, комплексы белков с липидами и углеводами, микробные экстракты, различные лизаты или фильтраты культур микробов.

Антитела, обуславливающие преципитирующее свойство иммунной сыворотки, называются преципитинами, а продукт реакции в виде осадка – преципитатом.

Преципитирующие сыворотки получают путем искусственной иммунизации животного живыми или убитыми микробами, а также разнообразными лизатами и экстрактами микробных клеток.

Путем искусственной иммунизации можно получить преципитирующие сыворотки к любому чужеродному белку растительного и животного происхождения, также к гаптенам при иммунизации животного полноценным антигеном, содержащим данный гаптен.

Механизм реакции преципитации аналогичен механизму реакции агглютинации. Действие преципитирующих сывороток на антиген сходно с действием агглютинирующих. И в том, и в другом случае под влиянием иммунной сыворотки и электролитов наступает укрупнение взвешенных в жидкости частиц антигена (уменьшение степени дисперсности). Однако для реакции агглютинации антиген берется в виде гомогенной мутной микробной взвеси (суспензии), а для реакции преципитации – в виде прозрачного коллоидного раствора.

Реакция преципитации является высоко чувствительной и позволяет обнаруживать ничтожно малые количества антигена.

Реакция преципитации применяется в лабораторной практике для диагностики чумы, туляремии, сибирской язвы, менингита и других заболеваний, а также в судебно – медицинской экспертизе.

В санитарной практике с помощью этой реакции определяют фальсификацию пищевых продуктов.

Реакцию преципитации можно ставить не только в пробирках, но и в геле, а для тонких иммунологических исследований антигена применяется метод иммунофореза.

Реакция преципитации в агаровом геле, или метод диффузной преципитации, позволяет детально изучить состав сложных водо – растворимых антигенных смесей. Для постановки реакции используют гель (полужидкий или более плотный агар). Каждый компонент, входящий в состав антигена, диффундирует навстречу соответствующему антителу с разной скоростью. Поэтому комплексы различных антигенов и соответствующих антител располагаются в различных участках геля, где и образуют линии преципитации. Каждая из линий соответствует только одному комплексу антиген – антитело. Реакцию преципитации обычно ставят при комнатной температуре.

Широкое распространение при изучении антигенной структуры микробной клетки получил метод иммунофореза.

Комплекс антигенов помещают в луночку, находящуюся в центре агарового поля, залитого на пластину. Через агаровый гель пропускают электрический ток. Различные антигены, входящие в комплекс, перемещаются в результате действия тока в зависимости от их электрофоретической подвижности. После окончания электрофореза в траншею, расположенную по краю пластины, вносят специфическую иммунную сыворотку и помещают во влажную камеру. В местах образования комплекса антиген – антитело появляются линии преципитации.

Реакция нейтрализации экзотоксина антитоксином (РН)

Реакция основана на способности антитоксической сыворотки нейтрализовать действие экзотоксина. Она применяется для титрования антитоксических сывороток и определения экзотоксина.

Реакцию флокуляции можно применять не только для титрования сыворотки (например, дифтерийной), но и для титрования токсина и анатоксина.

Реакция нейтрализации токсина антитоксином имеет большое практическое значение как метод определения активности антитоксических лечебных сывороток. Антигеном в этой реакции является истинный экзотоксин.

Сила антитоксической сыворотки определяется условными единицами АЕ.

1 АЕ дифтерийной антитоксической сыворотки - это то ее количество, которое нейтрализует 100 DLM дифтерийного экзотоксина. 1 АЕ ботулиновой сыворотки – ее количество нейтрализующее 1000 DLM ботулинового токсина.

Реакцию нейтрализации с целью определения видовой или типовой принадлежности экзотоксина (при диагностике столбняка, ботулизма, дифтерии и др.) можно проводить in vitro (по Рамону), а при определении токсигенности микробных клеток - в геле (по Оухтерлони).

Реакция лизиса (РЛ)

Одним из защитных свойств иммунной сыворотки является ее способность растворять микробы или клеточные элементы, поступающие в организм.

Специфические антитела, обуславливающие растворение (лизис) клеток, называются лизинами. В зависимости от характера антигена они могу быть бактериолизинами, цитолизинами, спирохетолизинами, гемолизинами и др.

Лизины проявляют свое действие только в присутствии дополнительного фактора – комплемента.

Комплемент, как фактор неспецифического гуморального иммунитета, обнаружен почти во всех жидкостях организма, кроме спинномозговой жидкости и жидкости передней камеры глаза. Довольно высокое и постоянное содержание комплемента отмечено в сыворотке крови человека и очень много его в сыворотке крови морской свинки. У остальных млекопитающих содержание комплемента в сыворотке крови различно.

Комплемент – это сложная система сывороточных протеинов. Он нестоек и разрушается при 55 градусах в течение 30 минут. При комнатной температуре комплемент разрушается в течение двух часов. Очень чувствителен к продолжительному встряхиванию, к действию кислот и ультрафиолетовых лучей. Однако, комплемент длительно (до шести месяцев) сохраняется в высушенном состоянии при низкой температуре.

Комплемент способствует лизису микробных клеток и эритроцитов.

Различают реакцию бактериолиза и гемолиза.

Суть реакции бактериолиза состоит в том, что при соединении специфической иммунной сыворотки с соответствующими ей гомологичными живыми микробными клетками в присутствии комплемента происходит лизис микробов.

Реакция гемолиза состоит в том, что при воздействии на эритроциты специфической, иммунной по отношению к ним сывороткой (гемолитической) в присутствии комплемента, наблюдается растворение эритроцитов, т.е. гемолиз.

Реакция гемолиза в лабораторной практике используется для определения тира комплемента, а также для учета результатов диагностических реакций связывания комплемента «Борде – Жангу» и «Вассермана».

Титр комплемента – это наименьшее его количество, которое обуславливает лизис эритроцитов в течение 30 минут в гемолитической системе в объеме 2,5мл. Реакция лизиса, как и все серологические реакции происходит в присутствии электролита.

Реакция связывания комплемента (РСК)

Эту реакцию применяют при лабораторных исследованиях для обнаружения антител в сыворотке крови при различных инфекциях, а также для идентификации возбудителя по антигенной структуре.

Реакция связывания комплемента относится к сложным серологическим реакциям и отличается высокой чувствительностью и специфичностью.

Особенностью этой реакции является то, что изменение антигена при его взаимодействии со специфическими антителами происходит только в присутствии комплемента. Комплемент адсорбируется только на комплексе «антитело – антиген». Комплекс «антитело – антиген» образуется только в том случае, если между антигеном и антителом, находящемся в сыворотке, имеется сродство.

Адсорбция комплемента на комплексе «антиген – антитело» может по - разному отразиться на судьбе антигена в зависимости от его особенностей.

Некоторые из антигенов подвергаются при этих условиях резким морфологическим изменениям, вплоть до растворения (гемолиз, феномен Исаева – Пфейфера, цитолитическое действие). Другие изменяют скорость передвижения (иммобилизация трепонем). Третьи погибают без резких деструктивных изменений (бактерицидное или цитотоксическое действие). Наконец, адсорбция комплемента может и не сопровождаться изменениями антигена, легко доступными для наблюдения (реакции Борде – Жангу, Вассермана).

По механизму РСК протекает в две фазы:
а) Первая фаза – это образование комплекса «антиген – антитело» и адсорбция на этом комплексе комплемента. Результат фазы визуально не видим.
б) Вторая фаза – это изменение антигена под влиянием специфических антител в присутствии комплемента. Результат фазы может быть видимым визуально или не видимым.

В случае, когда изменения антигена остаются недоступными для визуального наблюдения, приходится использовать вторую систему, выполняющую роль индикатора, позволяющую оценить состояние комплемента и сделать заключение о результате реакции.

Если реакция связывания комплемента положительна, то образуется комплекс антитело – антиген», адсорбирующий на себе комплемент. Поскольку комплемент используется в количестве необходимом только для одной реакции, а лизис эритроцитов может произойти только при наличии комплемента, то при его адсорбции на комплексе «антиген – антитело», лизис эритроцитов в гемолитической (индикаторной) системе не произойдет. Если реакция связывания комплемента отрицательная, комплекс «антиген – антитело» не образуется, комплемент остается свободным, и при добавлении гемолитической системы наступает лизис эритроцитов.

Реакция гемагглютинации (РГА)

В лабораторной практике пользуются двумя различными по механизму действия реакциями гемагглютинации.

В одном случае реакция гемагглютинации относится к серологическим. В этой реакции эритроциты агглютинируются при взаимодействии с соответствующими антителами (гемагглютининами). Реакцию широко используют для определения группы крови.

В другом случае реакция гемагглютинации не является серологической.

В ней склеивание эритроцитов вызывают не антитела, а особые вещества (гемагглютинины), образуемые вирусами. Например, вирус гриппа агглютинирует куриные эритроциты, вирус полиомиелита – обезьяньи. Эта реакция позволяет судить о наличии того или иного вируса в исследуемом материале.

Учет результатов реакции осуществляется по расположению эритроцитов. При положительном результате эритроциты располагаются рыхло, выстилая дно пробирки в виде «перевернутого зонтика». При отрицательном результате эритроциты оседают на дно пробирки компактным осадком («пуговичка»).

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

Это серологическая реакция, в которой специфические противовирусные антитела, взаимодействуя с вирусом (антигеном), нейтрализуют его и лишают способности агглютинировать эритроциты, т.е. тормозят реакцию гемагглютинации.

Высокая специфичность реакции торможения агглютинации позволяет с ее помощью определять вид, тип вирусов или выявлять специфические антитела в исследуемой сыворотке.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

Реакция основана на том, что иммунные сыворотки, к которым химическим путем присоединены флюорохромы, при взаимодействии с соответствующими антигенами, образуют специфический светящийся комплекс, видимый в люминесцентном микроскопе. Сыворотки, обработанные флюорохромами, называются люминесцирующими.

Метод высокочувствителен, прост, не требует выделения чистой культуры, т.к. микроорганизмы обнаруживются непосредственно в исследуемом материале. Результат можно получить через 30 минут после нанесения на препарат люминесцирующей сыворотки.

Реакцию иммунной флюоресценции применяют при ускоренной диагностике многих инфекций.

В лабораторной практике применяют два варианта реакции иммунофлюоресценции: прямой и непрямой.

Прямой метод – это когда антиген сразу обрабатывается иммунной флюоресцирующей сывороткой.

Непрямой метод иммунной флюоресценции заключатся в том, что изначально препарат обрабатывают обычной (не флюоресцирующей) иммунной диагностической сывороткой, специфической искомому антигену. Если в препарате имеется антиген специфический к данной диагностической сыворотке, то образуется комплекс «антиген – антитело», который увидеть нельзя. Если этот препарат дополнительно обработать лиминесцирующей сывороткой, содержащей специфические антитела к глобулинам сыворотки в комплексе «антиген – антитело», произойдет адсорбция люминесцирующих антител на глобулины диагностической сыворотки и как результат – в люминесцентный микроскоп можно увидеть светящиеся контуры микробной клетки.

Реакция иммобилизации (РИ)

Способность иммунной сыворотки вызывать иммобилизацию подвижных микроорганизмов связана со специфическими антителами, которые проявляют свое действие в присутствии комплемента. Иммобилизирующие антитела обнаружены при сифилисе, холере и некоторых других инфекционных заболеваниях.

Это послужило основанием для разработки реакции иммобилизации трепонем, которая по своей чувствительности и специфичности превосходит другие серологические реакции, используемые при лабораторной диагностике сифилиса.

Реакция нейтрализации вирусов (РНВ)

В сыворотке крови людей, иммунизированных или перенесших вирусное заболевание, обнаруживаются антитела, способные нейтрализовать инфекционные свойства вируса. Эти антитела выявляются при смешивании сыворотки с соответствующим вирусом и последующим введением этой смеси в организм восприимчивых лабораторных животных или заражением культуры клеток. На основании выживания животных или отсутствия цитопатического действия вируса судят о нейтрализующей способности антител.

Эта реакция широко используется в вирусологии для определения вида или типа вирус и титра нейтрализующих антител.

К современным методам диагностики инфекционных заболеваний следует отнести иммунофлюоресцентный метод обнаружения антигенов и антител, радиоимунный, иммуноферментный метод, метод иммуноблоттинга, обнаружение антигенов и антител при помощи моноклональных антител, метод обнаружения антигенов при помощи полимеразой цепной реакции (ПЦР – диагностика) и др.

1.1. РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ (РА)

РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ (РА)

Реакция агглютинации основана на специфичности взаимодействия антител (агглютининов) с целыми микробными или другими клетками (агглютиногенами). В результате такого взаимодействия образуются частицы агломераты, выпадающие в осадок (агглютинат) в виде хлопьев.

В реакции агглютинации могут участвовать как живые, так и убитые бактерии, спирохеты, грибы, простейшие, риккетсии, а также эритроциты и другие клетки. Реакция протекает в две фазы: первая (невидимая) специфическая, соединение антигена и антител, вторая (видимая) неспецифическая, склеивание антигенов, т.е. образование агглютината.

Агглютинат образуется при соединении одного активного центра двухвалентного антитела с детерминантной группой антигена. Реакция агглютинации, как и любая серологическая реакция, протекает в присутствии электролитов.

Внешне проявление положительной реакции агглютинации имеет двоякий характер. У безжгутиковых микробов, имеющих только соматический О антиген, происходит склеивание непосредственно самих микробных клеток. Такая агглютинация называется мелкозернистой. Он происходит в течение 18 22 часов. v

У жгутиковых микробов имеются два антигена соматический О антиген и жгутиковый Н антиген. Если клетки склеиваются жгутиками, образуются крупные рыхлые хлопья и такая реакция агглютинации называется крупнозернистой. Она наступает в течение 2 4 часов.

Кровь берут натощак или не ранее чем через 6 часов после еды (в противном случае в сыворотке крови могут быть капельки жира, делающие ее мутной и непригодной для исследования). Сыворотку крови больного обычно получают на второй неделе заболевания, набирая стерильно из локтевой вены 3 4 мл крови (к этому времени концентрируется максимальное количество специфических антител). В качестве известного антигена используется диагностикум, приготовленный из убитых, но не разрушенных микробных клеток конкретного вида с конкретной антигенной структурой.

ВАРИАНТЫ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ

В этих реакциях принимают участие антигены в виде частиц (микробные клетки, эритроциты и другие корпускулярные антигены), которые склеиваются антителами и выпадают в осадок.

Для постановки реакции агглютинации (РА) необходимы три компонента: 1) антиген (агглютиноген); 2) антитело (агглютинин) и 3) электролит (изотонический раствор натрия хлорида).

ОРИЕНТИРОВОЧНАЯ (ПЛАСТИНЧАТАЯ) РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ (РА)

Ориентировочная, или пластинчатая, РА ставится на предметном стекле при комнатной температуре. Для этого пастеровской пипеткой на стекло наносят раздельно каплю сыворотки в разведении 1:10 1:20 и контрольную каплю изотонического раствора натрия хлорида. В ту и другую бактериологической петлей вносят колонии или суточную культуру бактерий (каплю диагностикума) и тщательно перемешивают их. Реакции учитывают через несколько минут визуально, иногда с помощью лупы (х5). При положительной РА в капле с сывороткой отмечают появление крупных и мелких хлопьев, при отрицательной сыворотка остается равномерно мутной.

РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ (ПАССИВНОЙ) ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РНГА, РПГА)

Реакция ставится: 1) для обнаружения полисахаридов, белков, экстрактов бактерий и других высокодисперстных веществ, риккетсий и вирусов, комплексы которых с агглютининами в обычных РА увидеть не удается, или 2) для выявления антител в сыворотках больных к этим высокодисперстным веществам и мельчайшим микроорганизмам.

Под непрямой, или пассивной, агглютинацией понимают реакцию, в которой антитела взаимодействуют с антигенами, предварительно адсорбированными на инертных частицах (латекс, целлюлоза, полистерол, оксид бария и др. или эритроциты барана, I(0)группы крови человека).

Постановка. В лунках полистироловых планшетов готовят ряд последовательных разведений сыворотки. В предпоследнюю лунку вносят 0,5 мл заведомо положительной сыворотки и в последнюю 0,5 мл физиологического раствора (контроли). Затем во все лунки добавляют по 0,1 мл разведенного эритроцитарного диагностикума, встряхивают и помещают в термостат на 2 ч. v

Учет. В положительном случае эритроциты оседают на дне лунки в виде ровного слоя клеток со складчатым или зазубренным краем (перевернутый зонтик), в отрицательном оседают в виде пуговки или колечка.

1.2. РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ. ЛИЗИСА,
ОПСОНОФАГОЦИТАРНАЯ РЕАКЦИЯ, РЕАКЦИЯ ПОВЫШЕННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ

РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ ЭКЗОТОКСИНА АНТИТОКСИНОМ (РН)

При титровании сыворотки к разным разведениям антитоксической сыворотки прибавляется определенная доза соответствующего токсина. При полной нейтрализации антигена и отсутствия не израсходованных антител наступает инициальная флокуляция. Реакцию флокуляции можно применять не только для титрования сыворотки (например, дифтерийной), но и для титрования токсина и анатоксина. Реакция нейтрализации токсина антитоксином имеет большое практическое значение как метод определения активности антитоксических лечебных сывороток. Антигеном в этой реакции является истинный экзотоксин.

Сила антитоксической сыворотки определяется условными единицами АЕ.

1 АЕ ботулиновой сыворотки ее количество нейтрализующее 1000 DLM ботулинового токсина. Реакцию нейтрализации с целью определения видовой или типовой принадлежности экзотоксина (при диагностике столбняка, ботулизма, дифтерии и др.) можно проводить in vitro (по Рамону), а при определении токсигенности микробных клеток в геле (по Оухтерлони).

Реакция лизиса (РЛ)

Лизины проявляют свое действие только в присутствии дополнительного фактора комплемента. Комплемент, как фактор неспецифического гуморального иммунитета, обнаружен почти во всех жидкостях организма, кроме спинномозговой жидкости и жидкости передней камеры глаза. Довольно высокое и постоянное содержание комплемента отмечено в сыворотке крови человека и очень много его в сыворотке крови морской свинки. У остальных млекопитающих содержание комплемента в сыворотке крови различно.

Комплемент это сложная система сывороточных протеинов. Он нестоек и разрушается при 55 градусах в течение 30 минут. При комнатной температуре комплемент разрушается в течение двух часов. Очень чувствителен к продолжительному встряхиванию, к действию кислот и ультрафиолетовых лучей. Однако, комплемент длительно (до шести месяцев) сохраняется в высушенном состоянии при низкой температуре. Комплемент способствует лизису микробных клеток и эритроцитов.

Различают реакцию бактериолиза и гемолиза.

Реакция гемолиза в лабораторной практике используется для определения тира комплемента, а также для учета результатов диагностических реакций связывания комплемента. Титр комплемента это наименьшее его количество, которое обуславливает лизис эритроцитов в течение 30 минут в гемолитической системе в объеме 2,5мл. Реакция лизиса, как и все серологические реакции происходит в присутствии электролита.

РЕАКЦИИ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ (АЛЛЕРГИЧЕСКИЕ)

Определенные формы антигена при повторном контакте с организмом могут вызвать реакцию, специфическую в своей основе, но включающую неспецифические клеточные и молекулярные факторы острого воспалительного ответа. Известны две формы повышенной реактивности: гиперчувствительность немедленного типа (ГНТ) и гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ). Первый тип реакции проявляется при участии антител, при этом реакция развивается не позднее 2 ч после повторного контакта с аллергеном. Второй тип реализуется с помощью Тклеток воспаления, (Тгзт) как основных эффекторов реакции, обеспечивающих накопление в зоне воспаления макрофагов, реакция проявляется через 68 ч и позже.

Развитию реакции гиперчувствительности предшествует встреча с антигеном и возникновение сенсибилизации, т.е. появление антител, активно сенсибилизированных лимфоцитов и пассивно сенсибилизированных цитофильными антителами других лейкоцитов (макрофагов, гранулоцитов).

Реакции гиперчувствительности имеют три фазы развития: иммунологическую; патохимическую; патофизиологическую.

В первой, специфической, фазе аллерген взаимодействует с антителами и (или) сенсибилизированными клетками. Во второй фазе происходит выброс биологически активных веществ из активированных клеток. Освободившиеся медиаторы (гистамин, серотонин, лейкотриены, брадикинин и др.) вызывают различные периферические эффекты, свойственные соответствующему типу реакции третья фаза.

Реакции повышенной чувствительности четвертого типа

Реакции этого типа обусловлены патогенными межклеточными взаимодействиями сенсибилизированных Тхелперов, цитотоксических Тлимфоцитов (Ткиллеров) и активированных клеток системы мононуклеарных фагоцитов, вызванных длительной стимуляцией системы иммунитета бактериальными антигенами, при которой возникает относительная недостаточность системы иммунитета организма элиминировать из внутренней среды бактериальные возбудители инфекционных заболеваний. Данные реакции повышенной чувствительности обуславливают туберкулезные каверны легких, их казеозный некроз и общую интоксикацию у пациентов с туберкулезом. Кожный грануломатоз при туберкулезе и проказе в морфопатогенетическом отношении во многом составляется реакциями повышенной чувствительности четвертого типа.

Наиболее известный пример реакции повышенной чувствительности четвертого типа это реакция Манту, развивающаяся в месте внутрикожного введения туберкулина больному, организм и система которого сенсибилизированы к антигенам микобактерий. В результате реакции образуется плотная гиперемированная папула с некрозом в центре, которая появляется только через несколько часов (замедленно) после внутрикожного введения туберкулина. Формирование папулы начинается с выхода из сосудистого русла в межклеточные пространства мононуклеарных фагоцитов циркулирующей крови. Одновременно начинается эмиграция из сосудистого русла полиморфонуклеаров. Затем инфильтрация нейтрофилами спадает, и инфильтрат начинает преимуще ственно состоять из лимфоцитов и мононуклеарных фагоцитов. Этим реакция Манту отличается от реакции Артюса, при которой в месте поражения накапливаются преимущественно полиморфонуклеарные лейкоциты.

При реакциях повышенной чувствительности четвертого типа длительная стимуляция антигенами сенсибилизированных лимфоцитов приводит в местах патологических изменении тканей к патологически интенсивному и длительному высвобождению Тхелперами цитокинов. Интенсивный выброс цитокинов в локусах тканевых повреждений обуславливает гиперактивацию находящихся там клеток системы мононуклеарных фагоцитов, многие из которых в гиперактивированном состоянии образуют тяжи эпителиоидных клеток, а некоторые сливаются между собой с образованием гигантских клеток. Макрофаги, на поверхности которых экспонированы бактериальные и вирусные антигены могут уничтожаться через функционирование Ткиллеров (натуральных киллеров).

Реакция повышенной чувствительности четвертого типа индуцируется распознаванием чужеродного бактериального антигена сенсибилизированными по отношению к нему Тхелперами. Необходимое условие распознавания взаимодействие индукторов с антигенами, экспонированными на поверхности антигенпрезентирующих клеток после эндоцитоза и переработки мононуклеарными фагоцитами чужеродных иммуногенов. Еще одно необходимое условие экспонирование антигенов в комплексе с молекулами I класса из главного комплекса тканевой совместимости. После распознавания антигена сенсибилизированные хелперы высвобождают цитокины и, в частности, интерлейкин2, активирующий натуральные киллеры и мононуклеарные фагоциты. Активированные мононуклеарные фагоциты высвобождают протеолитические ферменты и свободные кислородные радикалы, что повреждает ткани.

Кожноаллергические пробы тесты на установление сенсибилизации организма к аллергенам, определение его инфицированности, например, туберкулезом, бруцеллезом, уровня коллективного иммунитета, например, к туляремии. По месту введения аллергена различают: 1) накожные пробы; 2) скарификационные; 3) внутрикожные; 4) подкожные. Клиническая реакция на аллерген при кожноаллергической пробе подразделяются на местные, общие и очаговые, а также на немедленные и замедленные.

Местные реакции медиаторного типа ГНТ возникают через 520 мин, выражаются в виде эритемы и волдыря, исчезают через несколько часов, оцениваются плюсовым методом по величине эритемы, измеряемой в мм. Местные реакции ГЗТ возникают через 2448 ч, держатся долго, проявляются в виде инфильтрата, иногда с некрозом в центре, оцениваются по величине инфильтрата в мм, также по плюсовой системе. При цитотоксическом и иммунокомплексном типах ГНТ гиперемия и инфильтрация отмечаются через 34 ч, достигают максимума на 68 ч и затихают примерно через сутки. Иногда наблюдаются комбинированные реакции.

1.3. РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РСК)

Особенностью этой реакции является то, что изменение антигена при его взаимодействии со специфическими антителами происходит только в присутствии комплемента. Комплемент адсорбируется только на комплексе «антитело антиген». Комплекс «антитело антиген» образуется только в том случае, если между антигеном и антителом, находящемся в сыворотке, имеется сродство.

Адсорбция комплемента на комплексе «антиген антитело» может по разному отразиться на судьбе антигена в зависимости от его особенностей.

Некоторые из антигенов подвергаются при этих условиях резким морфологическим изменениям, вплоть до растворения (гемолиз, феномен Исаева Пфейфера, цитолитическое действие). Другие изменяют скорость передвижения (иммобилизация трепонем). Третьи погибают без резких деструктивных изменений (бактерицидное или цитотоксическое действие). Наконец, адсорбция комплемента может и не сопровождаться изменениями антигена, легко доступными для наблюдения.

По механизму РСК протекает в две фазы:

Первая фаза это образование комплекса «антиген антитело» и адсорбция на этом комплексе комплемента. Результат фазы визуально не видим (взаимодействие антигена и антител при обязательном участии комплемента).
Вторая фаза это изменение антигена под влиянием специфических антител в присутствии комплемента. Результат фазы может быть видимым визуально или не видимым (выявление результатов реакции при помощи индикаторной гемолитической системы (эритроциты барана и гемолитическая сыворотка).

Разрушение эритроцитов гемолитической сывороткой происходит только в случае присоединения комплемента к гемолитической системе. Если же комплемент адсорбировался ранее на комплексе антигенантитело, то гемолиз эритроцитов не наступает.

Результат опыта оценивают, отмечая наличие или отсутствие гемолиза во всех пробирках. Реакцию считают положительной при полной задержке гемолиза, когда жидкость в пробирке бесцветна и эритроциты оседают на дно, отрицательной при полном лизисе эритроцитов, когда жидкость интенсивно окрашена («лаковая» кровь). Степень задержки гемолиза оценивают в зависимости от интенсивности окраски жидкости и величины осадка эритроцитов на дне (++++, +++, ++, +).

Эта индикаторная система представлена компонентами реакции гемолиза, в составе которой находятся бараньи эритроциты и гемолитическая сыворотка, содержащая к эритроцитам специфические антитела (гемолизины), но не содержащая комплемент. Эта индикаторная система добавляется в пробирки через час после постановки основной РСК. Если реакция связывания комплемента положительна, то образуется комплекс антитело антиген», адсорбирующий на себе комплемент. Поскольку комплемент используется в количестве необходимом только для одной реакции, а лизис эритроцитов может произойти только при наличии комплемента, то при его адсорбции на комплексе «антиген антитело», лизис эритроцитов в гемолитической (индикаторной) системе не произойдет. Если реакция связывания комплемента отрицательная, комплекс «антиген антитело» не образуется, комплемент остается свободным, и при добавлении гемолитической системы наступает лизис эритроцитов.

1.4. ДНКЗОНДЫ. ПОЛИМЕРАЗНОЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР),
ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ МЕТОД (ИФА), МЕТОД ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ АНТИТЕЛ (МФА)

МЕТОДЫ ГЕННОГО ЗОНДИРОВАНИЯ

Интенсивное развитие молекулярной биологии и создание совершенной методической базы генетических исследований явились основой генетической инженерии. В области диагностики возникло и бурно развивается направление по определению специфических нуклеотидных последовательностей ДНК и РНК, так называемое генное зондирование. В основе подобных методик лежит способность нуклеиновых кислот к гибридизации образованию двухцепочных структур за счет взаимодействия комплементарных нуклеотидов (АТ, ГЦ).

Для определения искомой последовательности ДНК (или РНК) специально создается, так называемый, зонд полинуклеотид с определенной последовательностью оснований. В его состав вводят специальную метку, позволяющую идентифицировать образование комплекса.

Хотя генное зондирование нельзя отнести к методам иммунохимического анализа, основной его принцип (взаимодействие комплементарных структур) методически реализуется теми же способами, что и индикаторные методы иммунодиагностики. Кроме того, методы генного зондирования позволяют восполнить информацию об инфекционном агенте в отсутствии его фенотипической экспрессии (вирусы, встроенные в геном, «молчащие» гены).

Для проведения анализа ДНК пробу подвергают денатурации с целью получения одноцепочных структур, с которыми и реагируют молекулы ДНК или РНКзонда. Для приготовления зондов используют либо различные участки ДНК (или РНК), выделенные из естественного источника (например, того или иного микроорганизма), как правило представленные в виде генетических последовательностей в составе векторных плазмид, либо химически синтезированные олигонуклеотиды. В некоторых случаях в качестве зонда применяют препараты геномной ДНК, гидролизованной на фрагменты, иногда препараты РНК, особенно часто рибосомальная РНК. В качестве метки используют те же индикаторы, что и при различных видах иммунохимического анализа: радиоактивные изотопы, флуоресцеины, биотоп (с дальнейшим проявлением комплексом авидинфермент) и т. п.

Порядок проведения анализа определяется свойствами имеющегося зонда

В настоящее время все чаще применяются коммерческие наборы, содержащие все необходимые ингредиенты.

В большинстве случаев процедуру проведения анализа можно разделить на следующие стадии: подготовка образцов (в том числе экстракция и денатурация ДНК), фиксация пробы на носителе (чаще всего полимерный мембранный фильтр), предгибридизация, собственно гибридизация, отмывание несвязавшихся продуктов, детекция. При отсутствии стандартного препарата ДНК или РНКзонда предварительно проводится его получение и введение метки.

Для подготовки пробы может быть необходимо предварительное «подращивание» исследуемого материала для идентификации отдельных колоний бактерий или увеличения концентрации вирусов в клеточной культуре. Проводится и непосредственный анализ образцов сыворотки крови, мочи, форменных элементов крови или цельной крови на присутствие инфекционного агента. Для освобождения нуклеиновых кислот из состава клеточных структур проводят лизис клеток, а в некоторых случаях очищают препарат ДНК с помощью фенола.

Денатурация ДНК, т. е. переход ее в одноцепочную форму, происходит при обработке щелочью. Затем образец нуклеиновых кислот фиксируют на носителе нитроцеллюлезной или нейлоновой мембране, обычно путем инкубации от 10 мин до 4 час при 80° С в вакууме. Далее, в процессе предгибридизации достигается инактивация свободных мест связывания для уменьшения неспецифического взаимодействия зонда с мембраной. Процесс гибридизации занимает от 2 до 20 ч, в зависимости от концентрации ДНК в образце, концентрации используемого зонда и его размера.

После окончания гибридизации и отмывания несвязавшихся продуктов проводится детекция образовавшегося комплекса. Если в состав зонда входит радиоактивная метка, то для проявления реакции мембрану экспонируют с фотопленкой (ауторадиография). Для других меток используют соответствующие процедуры.

Наиболее перспективным является получение нерадиоактивных (так называемых холодных) зондов. На этой же основе развивается методика гибридизации, позволяющая устанавливать наличие патогена в препаратах срезов, пунктатов ткани, что особенно важно при патоморфологическом анализе (гибридизация insitu).

Существенным этапом в развитии методов генного зондирования явилось использование полимеразной реакции амплификации (ПЦР). Этот подход позволяет увеличить концентрацию определенной (заранее известной) последовательности ДНК в пробе за счет синтеза многочисленных копий in vitro. Для проведения реакции к исследуемому образцу ДНК добавляют препарат фермента ДНКполимеразы, избыток дезоксинуклеотидов для синтеза и, так называемые, праймеры два типа олигонуклеотидов величиной 2025 оснований, соответствующих концевым участкам интересующей последовательности ДНК. Один из праймеров должен быть копией начала участка считывания кодирующей цепи ДНК при направлении считывания 53, а второй копией противоположного конца некодирующей цепи. Тогда при каждом цикле полимеразной реакции происходит удвоение количества ДНКкопий.

Для осуществления связывания праймеров необходима денатурация ДНК (плавление) при 94°С с последующим доведением смеси до 4055°С.

Для проведения реакции сконструированы программируемые инкубаторы микропроб, позволяющие легко чередовать изменения температуры, оптимальной для каждого этапа реакции.

Реакция амплификации позволяет существенно повысить чувствительность анализа при генном зондировании, что особенно важно при низкой концентрации инфекционного агента.

Одним из существенных достоинств генного зондирования с амплификацией является возможность исследования субмикроскопического количества патологического материала.

Другой особенностью метода, более важной для анализа инфекционного материала, является возможность выявления скрытых (молчащих) генов. Методы, связанные с использованием генного зондирования безусловно, будут более широко внедряться в практику диагностики инфекционных заболеваний по мере их упрощения и удешевления.

Методы ИФА и РИФ в большей степени носят качественный или полуколичественный характер. При очень низких концентрациях компонентов образование комплекса антиген антитело не может быть зарегистрировано ни визуально, ни простыми инструментальными средствами. Индикация комплекса антиген антитело в таких случаях может быть осуществлена, если в один из исходных компонентов антиген или антитело ввести метку, которую можно легко детектировать в концентрациях, сопоставимых с определяемой концентрацией анализируемого вещества.

В качестве метки могут использоваться радиоактивные изотопы (например, 125I), флюоресцентные вещества, ферменты.

В зависимости от используемой метки различают радиоиммуный (РИА), флюоресцентный иммунный (ФИА), иммуноферментый (ИФА) методы анализа и др. В последние годы широкое практическое применение получил ИФА, что связано с возможностью количественных определений, высокой чувствительности, специфичности и автоматизации учета.

Иммуноферментные методы анализа группа методов, которые позволяют выявить комплекс антиген антитело с помощью субстрата, который расщепляется ферментом с появлением окраски.

Суть метода заключена в соединении компонентов реакции антиген антитело с измеряемой ферментной меткой. Антиген или антитело, вступающие в реакцию, метятся ферментом. По превращению субстрата под действием фермента можно судить о количестве вступившего во взаимодействие компонента реакции антиген антитело. Фермент в данном случае служит маркером иммунной реакции и позволяет наблюдать ее визуально или инструментально.

Ферменты представляют собой очень удобные метки, поскольку их каталитические свойства позволяют им действовать в качестве усилителей, так как одна молекула фермента может способствовать образованию более 1?105 молекул продукта каталитической реакции в минуту. Необходимо подобрать такой фермент, который длительно сохраняет свою каталитическую активность, не теряет ее при связывании с антигеном или антителом, и обладает высокой специфичностью по отношению к субстрату.

Основные способы получения антител или антигенов, меченых ферментом, конъюгатов: химические, иммунологические и генноинженерные. Для постановки ИФА наиболее часто используются ферменты: пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, галактозидаза и др.

Для выявления активности фермента в комплексе антигенантитело с целью визуального и инструментального учета реакции используют хромогенные субстраты, растворы которых, изначально бесцветные, в процессе ферментативной реакции приобретают окраску, интенсивность которой пропорциональна количеству фермента. Так, для выявления активности пероксидазы хрена в твердофазном ИФА в качестве субстрата используют 5аминосалициловую кислоту, дающую интенсивное коричневое окрашивание, ортофенилендиамин, образующий оранжевожелтое окрашивание. Для выявления активности щелочной фосфатазы и?галатозидазы используют нитрофенилфосфаты и нитрофенилгалактозиды соответственно.

Результат реакции при образовании окрашенного продукта определяют визуально или с помощью спектрофотометра, измеряющего поглощение света с определенной длиной волны.

Известно много вариантов постановки ИФА. Различают гомогенный и гетерогенный варианты.

По методике постановки различают конкурентный и неконкурентный методы ИФА. Если на первой стадии в системе присутствуют только анализируемое соединение и соответствующие ему центры связывания (антиген и специфические антитела), то метод является неконкурентным. Если на первой стадии присутствуют анализируемое соединение (антиген) и его аналог (меченый ферментом антиген), конкурирующие между собой за связывание с имеющимися в недостатке центрами специфического связывания (антителами), то метод является конкурентным. В этом случае чем больше исследуемого антигена содержит раствор, тем меньше количество связывающихся меченых антигенов.

МЕТОД ФЛЮОРЕСЦИРУЮЩИХ АНТИТЕЛ (МФА) или РЕАКЦИИ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ (РИФ)

Иммунофлюоресцентный метод является методом выбора для быстрого выявления и идентификации неизвестного микроорганизма в исследуемом материале.

Аг + АТ + электролит = светящийся в УФ лучах комплекс

Микроб сыворотка, меченная флюорохромом

Часто используют краситель изотиоционат флюоресциина ФИТЦ

При исследовании этим методом используют люминесцентный микроскоп.

Постановка РИФ

На мазок наносят 30 мкл раствора ФИТЦмеченных антител.

Помещают стекло во влажную камеру и выдерживают при комнатной температуре в течение 2025 мин, или в термостате при 37°С в течение 15 мин.

Промывают стекло в проточной водопроводной воде 2 мин, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе.

На высушенный мазок наносят каплю монтирующей жидкости, мазок накрывают покровным стеклом и микроскопируют с использованием люминесцентного микроскопа или люминесцентной насадки к обычному оптическому микроскопу.

Реакции агглютинации
В этих реакциях принимают участие антигены в виде частиц (микробные клетки, эритроциты и другие корпускулярные антигены), которые склеиваются антителами и выпадают в осадок.
Для постановки реакции агглютинации (РА) необходимы три компонента: 1) антиген (агглютиноген); 2) антитело (агглютинин) и 3) электролит (изотонический раствор натрия хлорида).
Аг + АТ + электролит = агглютинат

1. Постановка ориентировочной реакции агглютинации (РА ) на стекле с целью идентификации бактерий кишечной группы.

Рис. 2. РА на стекле.

На предметное стекло наносят каплями:

1 -ая капля: - агглютинирующая сыворотка к возбудителям дизентерии;
2 -ая капля: - агглютинирующая сыворотка к возбудителям брюшного тифа;
3 -ья капля: - физиологический раствор (контроль).
Добавляют в каждую каплю исследуемую чистую культуру бактерий . Перемешивают.

Примечание : положительный результат - наличие хлопьев агглютината,
отрицательный - отсутствие хлопьев агглютината
Заключение: Исследуемые бактерии являются возбудителями брюшного тифа.

2. Учет результатов РНГА , поставленной с целью обнаружения ботулотоксина.

Возбудитель ботулизма - Clostridium botulinum вырабатывает токсины семи сероваров (А, B, C, D, E, F, G), однако чаще других встречаются серовары А, В, Е. Все токсины отличаются по антигенным свойствам и могут быть дифференцированы в реакциях типоспецифическими сыворотками . Для этой цели можно поставить реакцию пассивной (непрямой) гемагглютинации с сывороткой больного, в которой предполагается наличие токсина, и эритроцитами, нагруженными антителами антитоксических противоботулинических сывороток типов А, В, Е. Контролем служит нормальная сыворотка.

Рис. 3. Постановка и результат РНГА.

Учет зонтик пуговки или колечка.

Вывод: В сыворотке больного обнаружен ботулотоксин тип Е.

Реакция преципитации – это формированиеи осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах. Реакцию преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др.

3. Постановка и учет реакции кольцепреципитации для определения видовой принадлежности кровяного пятна.

Постановка . В узкую пробирку №1 диаметром 0,5 см с неразведенной преципитирующей сывороткой против белков крови человека в количестве 0,3-0,5 мл, держа ее в наклонном положении, пастеровской пипеткой медленно по стенке наслаивается такой же объем антигена (экстракт кровяного пятна ). В пробирку №2 приливают преципитационную сыворотку против белков барана, в пробирку №3 - физиологический раствор (контроль) и добавляют также, как в первую пробирку антиген. Пробирки осторожно, чтобы не смешать жидкости, ставят вертикально. При правильном наслоении преципитиногена на сыворотку четко обозначается граница между двумя слоями жидкости. Постановка реакции обязательно сопровождается контролями сыворотки и антигена.
Учет . Результаты реакции учитывают в зависимости от вида антигена и антител через 5-10 мин, 1-2 ч или через 20-24 ч. В случае положительной реакции в пробирке на границе между сывороткой и исследуемым экстрактом появляется преципитат в виде кольца белого цвета.

Рис. 4. Реакция кольцепреципитации.

4. Определение токсигенности коринебактерий дифтерии в реакции преципитации в агаре .

Эта издавна используемая реакция преципитации, предложенная для определения токсичности коринебактерий дифтерии, ставится на фосфатно-пептонном агаре в чашке Петри. Вдоль ее посередине помещают полоску стерильной фильтровальной бумаги, смоченной антитоксической сывороткой . После подсушивания на расстоянии 1 см от края полоски бляшками диаметром 10 мм подсевают выделенные культуры. В одной чашке можно сеять от 3 до 10 культур, одна из которых, контрольная, должна быть заведомо токсигенной. Посевы помещают в термостат.

Учет реакций проводят через 24-48-72 ч. Если культура токсигенная, на некотором расстоянии от полоски бумаги возникают линии преципитата, совпадающие с линиями преципитата контрольной культуры. Они имеют вид «стрел-усиков », которые хорошо видны в проходящем свете.

Рис. 5. Реакция преципитации в агаре.

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ ВЫЯВЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ

5. Постановка непрямой реакции гемагглютинации (РНГА ) выявления титра специфических антител у больного.

В реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) в качестве носителя используют эритроциты. Нагруженные антигеном эритроциты склеиваются в присутствии специфических антител к данному антигену и выпадают в осадок. Сенсибилизированные антигеном эритроциты используют в РПГА как эритроцитарный диагностикум для обнаружения антител (серодиагностика).
Постановка . В лунках полистироловых планшетов готовят ряд последовательных разведений сыворотки. В предпоследнюю лунку вносят - 0,5 мл заведомо положительной сыворотки и в последнюю 0,5 мл физиологического раствора (контроли). Затем во все лунки добавляют по 0,1 мл разведенного эритроцитарного диагностикума, встряхивают и помещают в термостат на 2 ч.
Учет . В положительном случае эритроциты оседают на дне лунки в виде ровного слоя клеток со складчатым или зазубренным краем (перевернутый зонтик ), в отрицательном - оседают в виде пуговки или колечка.

Рис. 6. Результат РНГА. Титр антител - 1:100.

6. Постановка развернутой реакции агглютинации с целью выявления титра специфических антител у больного.

Развернутая РА для серодиагностики ставится в сыворотке больных. Ее разводят и изотоническом растворе натрия хлорида от 1:50 - 1:100 до 1:800 или 1: 1600. Так как в более низких титрах сыворотки могут находиться нормальные агглютинины, имеющиеся у здоровых людей или больных с другим диагнозом (диагностический титр ). В качестве антигена в этой реакции используют диагностикумы - заведомо известные взвеси, как правило, убитых бактерий, с которыми безопасно работать.
Ставят реакцию следующим образом. В агглютинационные пробирки предварительно разливают по 1 мл изотонического раствора натрия хлорида. В первую из них доливают 1 мл сыворотки, разведенной 1:100, и, смешав ее, 1 мл переносят во вторую, из второй - в третью и т.д. В полученные двухкратные разведения сывороток (от 1:100 до 1:1600 и более) вносят по 1-2 капли взвеси бактерий, содержащей 3 млрд микробных тел в 1 мл. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при 37°С на 2 часа, затем сутки выдерживают при комнатной температуре.

Учет реакции развернутой агглютинации производят, оценивая последовательно каждую пробирку, начиная с контрольных, при осторожном встряхивании. В контрольных пробирках агглютинации не должно быть. Интенсивность реакции агглютинации отмечают следующими знаками:++++ - полная агглютинация (хлопья агглютината в абсолютной прозрачной жидкости); +++ - неполная агглютинация (хлопья в слабоопалесцирующей жидкости); ++ - частичная агглютинация (хлопья четко различимы, жидкость слегка мутная); + - слабая, сомнительная агглютинация - жидкость очень мутная, хлопья в ней плохо различимы; - - отсутствие агглютинации (жидкость равномерно мутная).
За титр сыворотки принимают последнее ее разведение , в котором интенсивность агглютинации оценивается не менее чем два плюса (++)

Рис. 7. Развернутая реакция агглютинации.

Иммунные реакции. Применение иммунных реакций в диагностике инфекционных заболеваний.

ПЛАН:

Виды иммунных реакций.

Условия проведения серологических реакций.

Требования к сыворотке.

Понятие положительный и отрицательный результат.

ОНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ:

Виды иммунных реакций.

Иммунологическая реакция – это взаимодействие антигена с антителом, которое определяется специфическим взаимодействием активных центров антитела (паратопа) с эпитопами антигенов.

Общая классификация иммунологических реакций:

серологические реакции – реакции между антигенами (Aг) и антителами (Ig)

in vitro ;

клеточные реакции с участием иммунокомпетентных клеток;

аллергические пробы – выявление гиперчувствительности.

Серологические реакции: 1) определение, 2) фазы, 3) цели постановки, 4) общая классификация.

1) Определение

Серологические методы исследования (от лат. Serum - сыворотка и logos - учение) с помощью реакции антиген-антитело.

2) Фазы

2 фазы взаимодействия:

I. Специфическая (видимая) – наступает быстро, aнтитела соединяются с соответствующими им антигенами. В эту фазу взаимодействуют детерминантные группы антигенов (АГ) и активных центров антител (АТ).

В образовании комплекса АГ+ АТ участвуют силы:

Кулона;

Ван дер Ваальса

Водородные связи.

Никаких видимых изменений в этой фазе нет. При электронной микроскопии комплекс АГ+АТ в виде решетки.

II. Неспецифическая – наступает медленно, образовавшийся комплекс антиген – антитело реагирует с дополнительным неспецифическим фактором среды, в которых происходит реакция, и это видимо глазом – склеивание, растворение, выпадение хлопьев осадка и т. п. В присутствии электролита снижается заряд, уменьшается растворимость, образуются видимые конгломераты, выпадающие в осадок (агглютинат).

3) Цели постановки :

а) для идентификации антигена (антитело известно-диагностическая сыворотка):

б) для выявления антител (Ig) (антиген известен-диагностикум):

4) Общая классификация серологических реакций :

а) простые (2-х компонентные: Ag+Ig):

реакции агглютинации РА (с корпускулярным антигеном);

реакции преципитации РП (с растворимым антигеном);

б) сложные (3-х компонентные: Ag+Ig+C);

в) с использованием метки.

Варианты реакции агглютинации и преципитации

Реакция агглютинации :

Реакция агглютинации (РА) - иммунная реакция взаимодействия суспензии АГ (эритроцитов, бактерий) с АТ в физиологическом растворе.

При агглютинации происходит склеивание частиц АТ с образованием хлопьевидного осадка.

Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) является разновидностью реакции агглютинации, в которой используют антительный или антигенный эритроцитарный диагностикум (эритроциты с адсорбированными на их поверхности АТ или АГ).

Эритроциты в этой реакции выполняют роль пассивных носителей.

Оценка результатов РПГА проводится следующим образом:

- при положительной реакции пассивно склеенные эритроциты покрывают дно U- или V-образной лунки ровным слоем с фестончатыми краями («зонтик»);

- при отрицательной реакции (отсутствии агглютинации) эритроциты скапливаются в центральном углублении лунки, образуя компактную «пуговку» с резко очерченными краями.

Реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) используют при диагностике вирусных инфекций. Некоторые вирусы содержат на своей поверхности белок гемагглютинин, склеивающий эритроциты. Добавление специфических противовирусных АТ блокирует вирусный гемагглютинин - гемагглютинация отсутствует.

Реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА), или реакцию Кумбса, применяют для определения неполных АТ. Добавление антиглобулиновой сыворотки (АТ против Ig человека) усиливает результаты реакции. РНГА применяют при определении резус-фактора.

Для постановки реакции агглютинации (РА) необходимы три компонента:

1) антиген (агглютиноген) АГ;

2) антитело (агглютинин) АТ;

3) электролит (изотонический раствор натрия хлорида).
Аг + АТ + электролит = агглютинат

Агглютинация (от лат. agglutinatio - склеивание) - склеивание корпускул (бактерий, эритроцитов и др.) антителами в присутствии электролитов - натрия хлорида.

РА проявляется в виде хлопьев или осадка, состоящих из корпускул-тел (например бактерий, эритроцитов), "склеенных" антителами.

РА используют для:

Реакция прямой агглютинации микробов (РА).

В этой реакции антитела (агглютинины) непосредственно агглютинируют корпускулярные антигены (агглютиногены).

Обычно они представлены взвесью инактивированных микроорганизмов (реакция микробной агглютинации).

Для определения вида микроорганизмов используют стандартные диагностические агглютинирующие сыворотки ( известные АТ ).

Наиболее распространены пластинчатая (ориентировочная) и развернутая РА.

Пластинчатую РА ставят на стекле. Используют ее как ускоренный метод обнаружения антител или идентификации микроорганизмов.

Компоненты:

1. стандартные диагностические агглютинирующие сыворотки (АТ);

2. исследуемая чистая культура от пациента;

3. физ.раствор.

В исследуемой чистой культуре антигены (АГ) в виде частиц (микробные клетки, эритроциты и другие корпускулярные антигены), которые склеиваются антителами и выпадают в осадок.

Пример:

Постановка ориентировочной реакции агглютинации (РА ) на стекле с целью идентификации бактерий кишечной группы.

На предметное стекло наносят каплями:

1 дизентерии ;
2 -ая капля: - агглютинирующая сыворотка к возбудителям брюшного тифа ;

(1-2 диагностические сыворотки)
3 -я капля: - физиологический раствор (контроль).
Добавляют в каждую каплю исследуемую чистую культуру бактерий. Перемешивают.

Результат : положительный - наличие хлопьев агглютината,
отрицательный - отсутствие хлопьев агглютината
Заключение: Исследуемые бактерии являются возбудителями брюшного тифа (определялись антигены).

Для определения АТ в сыворотке больного (серологический диагноз) используют стандартный микробный диагностикум , содержащий взвесь известных микробов или их антигенов АГ .

Определение групп крови системы АВО (реакция гемагглютинации (РГА)) – агглютинируют эритроциты.

Компоненты реакции:

1. АГ (эритроциты крови) исследуемая кровь

2. АТ (эритротесты- цоликлоны)

Набор цоликлонов:

Реагент Цоликлон анти-А (розовый)

Реагент Цоликлон анти-В (синий)

Реагент Цоликлон анти-АВ (бесцветный)

3. электролит (физиологический раствор)

Техника определения:

1 .

В лунки планшета наносится по одной капле (0,1 мл) цоликлона анти - А, анти - В и анти – АВ (для контроля).

Рядом с каждой каплей реагента наносится маленькую (0,05-0,01 мл) каплю исследуемой крови.

Затем капля цоликлона смешивается с каплей крови индивидуальной чистой стеклянной палочкой.

Реакция агглютинации развивается в течение первых 3-5 секунд при мягком покачивании пластинки.

Результаты реакции учитываются через 2,5 - 3 минуты после смешивания капель. Слева направо в лунках анти-А, анти-В, анти-АВ.

Положительный результат-появление зернистого осадка (агглютината).

положительная РА (+)

Отрицательный - осадка нет.

отрицательная РА(-)

Анализ результатов.

O (I ) α β – агглютинации нет

A (II ) β – агглютинация с анти-А

B (III ) α – агглютинация с анти-В

AB (IV )О – агглютинация с анти-А, с анти-В

Схематичное изображение агглютинации.

Антигены АГ на эритроцитах (определяемые) + антитело АТ (цоликлон) диагностическая сыворотка

Учет агглютинации в планшетах

Реакция преципитации:

Реакция преципитации - иммунная реакция взаимодействия АГ в растворимом состоянии с АТ в физиологическом растворе.

При преципитации происходит образование макромолекулярного иммунного комплекса, что проявляется переходом прозрачного коллоидного раствора в непрозрачную суспензию, или преципитат.

Количество обоих реагентов должно быть в строго определенных соотношениях, так как избыток одного из них снижает результат.

Существуют различные способы постановки реакции преципитации.

1. Реакцию кольцепреципитации ставят в преципитационных пробирках с малым диаметром. В пробирку вносят иммунную сыворотку и осторожно наслаивают растворимый АГ. АГ и АТ смешиваются за счет теплового движения молекул, и они взаимодействуют. При положительном результате на границе двух растворов образуется кольцо непрозрачного преципитата.

2. Реакцию двойной иммунодиффузии по Оухтерлони проводят в агаровом геле, в лунки которого вносят по схеме либо раствор АГ, либо раствор АТ. АГ и АТ диффундируют в гель навстречу друг другу и при положительном результате реакции образуют иммунные комплексы, видимые как линии преципитации.

Реакция преципитации – это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах.

Компоненты РА:

преципитирующая сыворотка (известное АТ-преципитин);

исследуемая сыворотка (неизвестный АГ-преципитиноген);

физ. Раствор.

Реакцию преципитации ставят в или в специальных узких пробирках (реакция кольцепреципитации), или в чашках Петри в гелях, питательных средах и др.

Реакция кольцеприципитации

Постановка и учет результатов реакции кольцепреципитации для обнаружения возбудителя сибирской язвы (Асколи реакция).

Постановка .

1. Исследуемый материал (кожа, шерсть, войлок, щетина, сукно, мясо, земля, испражнения животных и т. д.) кипятят в физ растворе5-45 мин. для получения изотонической вытяжки (экстракта). Фильтруют.

2. В пробирку наливают преципитирующую противосибиреязвенную сыворотку.

3. Осторожно наслаивают на нее исследуемый материал (экстракт).

Учет .

В течение ближайших 10 мин. на границе между сывороткой и экстрактом в положительных случаях появляется кольцо помутнения (кольцепреципитация). Асколи реакция очень чувствительна и специфична

С ее помощью удается быстро выявить материалы, инфицированные сибирской язвой.

Реакция преципитации в агаре

Постановка и учет результатов реакции преципитации в агаре для определения токсигенности коринебактерий (возбудители дифтерии)

Постановка

Ставится на фосфатно-пептонном агаре в чашке Петри.

1. Вдоль чашки посередине помещают полоску стерильной фильтровальной бумаги, смоченной антитоксической сывороткой .

2. После подсушивания на расстоянии 1 см от края полоски бляшками диаметром 10 мм подсевают выделенные культуры .

В одной чашке можно сеять от 3 до 10 культур, одна из которых, контрольная , должна быть заведомо токсигенной .

Посевы помещают в термостат.

Учет

Анализ проводят через 24-48-72 ч.

Положительный результат - (культура токсигенная) - на некотором расстоянии от полоски бумаги возникают линии преципитата , « стрелы-усики », которые хорошо видны в проходящем свете.

На рисунке представлена реакция преципитации в агаре на определение токсигенности дифтерийных палочек. Средние культуры не образовали «стрел-усиков», это не токсикогенные возбудители.

Штаммы возбудителя дифтерии могут быть токсигенными (продуцирующими экзотоксин) и нетоксигенными. Образование экзотоксина зависит от наличия в бактериях профага, несущего tox-ген, кодирующий образование экзотоксина.

При заболевании все возбудители дифтерии тестируются на токсигенность - продукцию дифтерийного экзотоксина с помощью реакции преципитации в агаре

Сложные серологические реакции ( 3–х компонентные:Aг+Ig+C):

Реакция связывания комплемента (РСК).

Реакцию проводят в два этапа.

На первом этапе АТ взаимодействуют с АГ и комплементом, на втором этапе добавляют индикатор - гемолитическую систему (смесь эритроцитов и антиэритроцитарной сыворотки).

При положительном результате на первом этапе АТ образуют с АГ иммунный комплекс, связывающий комплемент реакционной смеси.

В этом случае эритроциты гемолитической системы, добавленные на втором этапе, не разрушаются.

В противном случае несвязанный комплемент вызывает лизис индикаторных эритроцитов.

Для ее проведения необходимо пять ингредиентов: АГ, AT и комплемент (первая система), эритроциты барана и гемолитическая сыворотка (вторая система) (рис.1).

Реакция протекает в две фазы (рис. 3).

Первая фаза - взаимодействие антигена и антител при обязательном участии комплемента.

Вторая - выявление результатов реакции при помощи индикаторной гемолитической системы (эритроциты барана и гемолитическая сыворотка). Разрушение эритроцитов гемолитической сывороткой происходит только в случае присоединения комплемента к гемолитической системе. Если же комплемент адсорбировался ранее на комплексе антиген-антитело, то гемолиз эритроцитов не наступает (рис).

Результат опыта оценивают (рис.2), отмечая наличие или отсутствие гемолиза во всех пробирках. Реакцию считают положительной при полной задержке гемолиза, когда жидкость в пробирке бесцветна и эритроциты оседают на дно, отрицательной - при полном лизисе эритроцитов, когда жидкость интенсивно окрашена («лаковая» кровь).

Степень задержки гемолиза оценивают в зависимости от интенсивности окраски жидкости и величины осадка эритроцитов на дне (++++, +++, ++, +).

Рис. 4. Постановка и результат РСК.

Вывод: В исследуемой сыворотке выявлены антитела.

РСК позволяет выявить антитела к любому штамму одного и того же серотипа вируса.

Диагностическое значение имеет:

четырехкратное увеличение титра антител в парных сыворотках (в период эпидемии гриппа) ;

двукратное нарастание в сыворотках крови больных при характерной клинической картине.

Реакции с использованием метки :

Эти методы высокочувствительны. В качестве метки антигенов или антител применяют красители, радиоактивные изотопы, ферменты и др.

РИФ – реакция иммунофлюоресценции

Реакция иммунофлуоресценции основана на световой индикации комплекса антиген-антитело

Иммуноферментный анализ.

Современное лабораторное исследование, в ходе которого ведется поиск специфических антител в крови либо антигенов к конкретным заболеваниям с целью выявления не только этиологии, но и стадии болезни.

Результаты ИФА могут выдаваться качественно и количественно.

В настоящее время ИФА применяется в следующих ситуациях:

1) поиск специфических антител к любому инфекционному заболеванию;

2) поиск антигенов каких-либо заболеваний (инфекционных, венерологических);

3) исследование гормонального статуса пациента;

4) обследование на онкомаркеры;

5) обследование на предмет наличия аутоиммунных заболеваний.

На рисунке твердофазный ИФА – известные АГ (слева) адсорбировн а на лунке планшета, (справа) на лунках планшета известные АТ

Преимущества метода ИФА:

1) Высокая специфичность и чувствительность метода ИФА (более 90%).

2) Возможность определения заболевания и отслеживания динамики процесса, то есть сравнивание количества антител в разных временных промежутках.

3) Доступность ИФА-диагностики в любом медицинском учреждении.

Относительный недостаток:Выявление иммунного ответа (антител), но не самого возбудителя., конъюгированных с ферментом-меткой.

Постановка ИФА (общий механизм):

Основу иммуноферментного анализа составляет иммунная реакция антигена и антитела с образованием иммунного комплекса: антиген-антитело, в результате которого происходит изменение ферментативной активности специфических меток на поверхности антител.

Компоненты реакции:

1. АГ(АТ) известное – на лунке планшета.

2. АТ (АГ) исследуемое.

3. АТ с ферментом, специфичное комплексу АТ(АГ)-АГ(АТ)

4.хромогенный субстрат, взаимодействующий с фермент

5. стоп раствор

Основные этапы проведения ИФА

1. На поверхности лунок планшета находится очищенный антиген определенного возбудителя. В них добавляется биологический материал пациента происходит специфическая реакция между этим антигеном и искомым антителом (иммуноглобулином). Образуется комплекс.

2. Добавляется конъюгант – АТ с ферментом. Конъюгант специфичен к комплексу АТ- АГ первого этапа. Фермент активизируется.

3. Добавляется субстрат и активный фермент взаимодействует с ним, изменяя бесцветный цвет раствора.

4. Добавляется стоп раствор для прекращения взаимодействия фермент-субстрат.

Учет.

Положительный результат- изменение цвета, на рисунке – желтый цвет.

Иммунохроматографический анализ

Метод иммунохроматографического анализа (ИХА, экспресс-тесты) – качественный скрининговый предварительный метод, позволяющий быстро, в течение нескольких минут, провести анализ в любых условиях, в т.ч. «полевых».

К преимуществам ИХА следует отнести:

Быстроту и легкость в использовании;

Малые объемы образца, отсутствие пробоподготовки;

Дешевизну для производителя и потребителя;

Возможность производства тестов в больших объемах;

Простоту чтения и интерпретации результата;

Высокую чувствительность и вопроизводимость;

Возможность количественного определения;

Возможность использования портативных ридеров, совместимых с компьютером;

Возможность мультианализа.

Компоненты (нанесены на тест-полоску):

1. Конъюгат с меткой коллоидного золота – специфичен к определяемому АГ.

2. АТ тестовой линии – специфичны к комплексу АТ-АГ

3. АТ контрольной линии – специфичны к конъюгату.

Постановка ИХА:

1.Нанесение образца на обозначенный стартовый участок полоски.

2. Получение результата в виде появления окрашенных полос на месте тестовой и контрольной линии.

Учет

Положительный – при окрашивании тестовой линии.

Отрицательный - при отсутствии окрашивания тестовой линии.

Недостоверный – при отсутствии окрашивания контрольной линии.

Общий механизм ИХА:

1. Образец вносится на стартовое поле (подушку образца) и связывается с конъюгатом (специфичное тело с цветной меткой), которые находятся на подушке конъюгата. В результате образуется окрашенный комплекс.

2. Образовавшийся окрашенный иммунный комплекс движется под действием капиллярных сил вдоль нитроцеллюлозной мембраны и взаимодействует с АТ тестовой линии. В результате появляется одна окрашенная розово-красная полоса.

3. Не связавшиеся на тестируемой полосе АТ (конъюгат) движется дальше и достигает контрольной линии, связывается с АТ контрольной линии. В результате появляется вторая окрашенная полоса. Если анализ проведен правильно, Контрольная линия должна проявляться всегда, независимо от присутствия исследуемого антигена (антитела) в образце биологической жидкости.

2. Условия проведения серологических реакций.

1. Наличие гомологичных – соответствующих друг другу антигена и антитела.

2. Чистая, сухая посуда.

3. Определенное соотношение препаратов (чаще всего равное).

4. Обязательное присутствие электролита (изотонический раствор NaCl).

5. рН нейтральный или близкий к слабощелочному.

6. Температура +37°С или комнатная (обязательно плюсовая).

7. Проводится контроль антигена и контроль сыворотки (антител).

3 Требования к сыворотке

Сыворотка должна быть совершенно прозрачная без примеси клеток

Получают на 2 неделе болезни обычно, когда уже есть в наличии антитела.

Кровь берут в количестве 3-5 мл натощак или через 6 ч. после еды.

Для получения сыворотки кровь оставляют на 1 час при комнатной температуре или центрифугируют. Отсасывают сыворотку очень осторожно, чтобы не захватить форменные элементы.

Иммунные сыворотки получают из крови людей или животных (чаще кроликов и лошадей), иммунизированных по определённой схеме соответствующим антигеном (вакциной). Готовят сыворотки обычно на производстве.

4. Понятие положительный и отрицательный результат.

РА.

При положительной реакции пассивно склеенные эритроциты покрывают дно лунки ровным слоем с фестончатыми краями («зонтик»); при отсутствии агглютинации эритроциты скапливаются в центральном углублении лунки, образуя компактную «пуговку» с резко очерченными краями (см. рисунки выше).

РП.

При положительном результате на границе двух растворов образуется кольцо молочного цвета (см. рисунки выше).

ИФА.

Изменение цвета раствора происходит при положительной реакции.

РСК.

Задержка гемолиза - реакция положительна; если комплемент свободен, наблюдается гемолиз - реакция отрицательна (см. рисунки выше).

Результаты реакции Вассермана:

а - полная задержка гемолиза (+ + ++);

б - выраженная задержка гемолиза (+ ++);

в - частичная задержка гемолиза (++);

г - слабая задержка гемолиза (+);

д - полный гемолиз (-).

Реакция положительна при частичной, выраженной и полной задержке гемолиза, определяемой по степени окрашивания содержимого пробирок от светло-розового до ярко-красного негемолизированные эритроциты впоследствии образуют осадок красного цвета.

Домашнее задание:

1. Изучите материал

Составьте 3 конспекта по видео

Иммунологические реакции в диагностике инфекционных заболеваний. Клеточные основы иммунологических реакций Постановка реакции хеддльсона при бруцеллезе

Реакция агглютинации (РА)

Реакция непрямой или пассивной гемагглютинации (РПГА)

Реакция преципитации (РП)

Реакция нейтрализации экзотоксина антитоксином (РН)

Реакция лизиса (РЛ)

Реакция связывания комплемента (РСК)

Реакция гемагглютинации (РГА)

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

Реакция иммобилизации (РИ)

Реакция нейтрализации вирусов (РНВ)

РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ (РА)

ВАРИАНТЫ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ

ОРИЕНТИРОВОЧНАЯ (ПЛАСТИНЧАТАЯ) РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ (РА)

РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ (ПАССИВНОЙ) ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РНГА, РПГА)

1.2. РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ. ЛИЗИСА,
ОПСОНОФАГОЦИТАРНАЯ РЕАКЦИЯ, РЕАКЦИЯ ПОВЫШЕННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ

РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ ЭКЗОТОКСИНА АНТИТОКСИНОМ (РН)

РЕАКЦИИ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ (АЛЛЕРГИЧЕСКИЕ)

1.3. РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РСК)

1.4. ДНКЗОНДЫ. ПОЛИМЕРАЗНОЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР),
ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ МЕТОД (ИФА), МЕТОД ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ АНТИТЕЛ (МФА)

МЕТОДЫ ГЕННОГО ЗОНДИРОВАНИЯ

МЕТОД ФЛЮОРЕСЦИРУЮЩИХ АНТИТЕЛ (МФА) или РЕАКЦИИ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ (РИФ)

Похожие статьи

Читайте также

Реакция агглютинации (РА)

Реакция непрямой или пассивной гемагглютинации (РПГА)

Реакция преципитации (РП)

Реакция нейтрализации экзотоксина антитоксином (РН)

Реакция лизиса (РЛ)

Реакция связывания комплемента (РСК)

Реакция гемагглютинации (РГА)

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

Реакция иммобилизации (РИ)

Реакция нейтрализации вирусов (РНВ)

РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ (РА)

ВАРИАНТЫ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ

ОРИЕНТИРОВОЧНАЯ (ПЛАСТИНЧАТАЯ) РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ (РА)

РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ (ПАССИВНОЙ) ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РНГА, РПГА)

1.2. РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ. ЛИЗИСА, ОПСОНОФАГОЦИТАРНАЯ РЕАКЦИЯ, РЕАКЦИЯ ПОВЫШЕННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ

РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ ЭКЗОТОКСИНА АНТИТОКСИНОМ (РН)

РЕАКЦИИ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ (АЛЛЕРГИЧЕСКИЕ)

1.3. РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РСК)

1.4. ДНКЗОНДЫ. ПОЛИМЕРАЗНОЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР), ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ МЕТОД (ИФА), МЕТОД ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ АНТИТЕЛ (МФА)

МЕТОДЫ ГЕННОГО ЗОНДИРОВАНИЯ

МЕТОД ФЛЮОРЕСЦИРУЮЩИХ АНТИТЕЛ (МФА) или РЕАКЦИИ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ (РИФ)

Похожие статьи

Читайте также

1.2. РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ. ЛИЗИСА,
ОПСОНОФАГОЦИТАРНАЯ РЕАКЦИЯ, РЕАКЦИЯ ПОВЫШЕННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ

1.4. ДНКЗОНДЫ. ПОЛИМЕРАЗНОЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР),
ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ МЕТОД (ИФА), МЕТОД ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ АНТИТЕЛ (МФА)