Биохимические методы анализа. Методы генетики Близнецовость у человека, критерии определения идентичности близнецов
Биохимические методы применяются в лабораторной диагностике наследственных болезней с начала XX века. Биохимические показатели отражают сущность бо-лечни более адекватно, чем клинические симптомы, не только в диагностическом, но и в генетическом аспекте. Биохимические методы направлены на выявление биохимического фенотипа организма. Фенотип оценивается на рзных уровнях: от первичного продукта гена (полипептидной цепи) до конечных метаболитов в моче и поте. Значимость этих методов повышалась по мере описания наследственных болезней и совершенствования методов (электрофорез, хроматография. спектроскопия и др.). Исходная схема обследования строится на клинической картине болезни, генеалогических сведениях и биохимической стратегии, которые позволяют определить дальнейший ход обследования на основе поэтапного исключения определенных классов болезней (просеивающий метод). Биохимические методы многоступенчаты, для их проведения требуется аппаратура разных классов Объектами биохимической диагностики могут быть моча. пот. плазма и сыворотка крови, форменные элементы крови, культуры клеток (фибробласты. лимфоциты) При использовании просеивающего метода выделяют два уровня: первичный и уточняющий. Основная цель первичной диагностики - выявить здоровых индивидов и отобрать индивидов для последующего уточнения диагноза. В качестве объектов в таких программах используются моча и небольшое количество крови. Программы первичной биохимической диагностики могут быть массовыми и селективными.
Селективные программы предусматривают проверку биохимических аномалий обмена (моча, кровь) у пациентов, у которых подозреваются генные наследственные болезни. В таких программах используются простые качественные реакции (например, тест с хлоридом железа для выявления фенилкетонурии) или более точные методы, позволяющие обнаруживать большие группы отклонений. С помощью тонкослойной хроматографии можно диагностировать наследственные нарушения обмена аминокислот, олигосахаридов. гликозаминогликанов (мукополиса-харидов). Газовая хроматография применяется для выявления наследственных болезней обмена органических кислот С помощью электрофореза гемоглобинов диагностируется вся группа гемоглобинопатий. Для углубления биохимического анализа иногда требуется не только количественное определение метаболита, но и определение активности фермента (использование нативных тканей или культивированных клеток), например, с помощью флюорометрических методик. Многие этапы биохимической диагностики осуществляются автоматическими приборами, в частности, аминоаналюаторами. Программа селективного скринияга на наследственные болезни обмена веществ с острым течением и ранним летальным исходом разработают в Медико-генетическом научном центре РАМН. Она состоит из двух этапов. Первый этап включает качественные и количественные тесты с мочой и кровью на белок, кетокислоты, цистин. гомоцистин. креатинин и др. Второй этап
основан на методах тонкослойной хроматографии мочи и крови для выявления аминокислот, фенольных кислот, моно- и дисахаридов и др. Показания для биохимических методов:
наличие у новорожденных судорог, комы, рвоты, гипотонии, желтухи.
специфический запах мочи и пота у ребенка.
ацидоз, нарушение кислотно-основного состояния.
остановка роста.
у детей во всех случаях подозрения на наследственные болезни обмена (задержка умственного и физического развития, потеря приобретенных функций, специфическая для какой-либо наследственной болезни клиническая картина).
Диагностика у взрослых наследственных болезней и гетерозиготных состояний (недостаточность глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы. гепато-церебральная дистрофия и др.).
Массовые просеивающие программы
В основе программы лежит концепция доклинической диагностики и возможности нормокопирования фенотипа. Для нескольких болезней разработаны не только теоретические основы диагностики (до развития клинической картины), но и методы профилактического лечения. Эти программы называются скрининговыми (просеивающими). Идея просеивания родилась в США в начале XX века. Общими характеристиками скрининга являются:
1)массовый и безотборный характер обследования:
2)профилактическая направленность.
3) двухэтапность диагностики.
Просеивание - это идентификация нераспознанных болезней с помощью быстро осуществляемых проверок (тестов). Такой подход обеспечивает отбор лиц с вероятным заболеванием из тех. у которых это заболевание клинически отсутствует. Группа лиц с высокой вероятностью заболевания должна быть повторно обследована с применением уточняющих диагностических методов, позволяющих либо исключить предполагаемый диагноз, либо подтвердить его у конкретного лица.
Массовому просеиванию подлежат наследственные болечни, которые отвечают следующим критериям.
1. Без своевременного профилактического лечения болезнь существенно снижает жизнеспособность, приводит к инвалидности. Больной нуждается в специальной помощи.
2. Имеются биохимические или молекулярно-генетические методы для точной диагностики заболевания на доклинической стадии.
3. Для выявляемой болезни необходимо иметь эффективные методы лечения.
4. Частота выявляемой болезни должна быть в пределах 1:10000 и выше.
Диагностические методы массового просеивания должны отвечать следующим критериям.
1. Экономичность. Методы должны быть технически простыми и дешевыми для массовых исследований.
2. Диагностическая значимость.
3. Надежность или воспроизводимость. Результаты обследования должны одинаково воспроизводиться в работе разных исследователей.
4. Доступность биологического материала. Метод должен быть приспособлен к анализу биологического материала, легко получаемого в малом количестве, хорошо сохраняемого и приемлемого для пересылки в централизованную лабораторию.
Основная цель программ массового просеивания новорожденных на наследственные болезни - раннее выявление заболевания на доклинической стадии и организация лечения.
Программа включает следующие этапы:
1. Взятие биологического материла у всех новорожденных и его доставка в лабораторию.
2. Лабораторная просеивающая диагностика.
3. Уточняющая диагностика всех случаев с положительными результатами.
4. Лечение больных и их диспансеризация с контролем за ходом лечения.
5. Медико-генетическое консультирование семьи.
В России проводится неонатальный скрининг двух наследственных болезней -фенилкетонурии (ФКУ) и врожденного гипотиреоза (ВГ).
Биологическим материалом для просеивающей диагностики ФКУ являются высушенные на хроматографической бумаге (или фильтровальной бумаге) пятна капиллярной крови новорожденных. Определяется концентрация фенилаланина чаще всего флюориметрическим количественным методом.
При ВГ в образцах крови новорожденных определяют концентрацию тироксина (Т4) и тиреотропного гормона (ТТГ) с помощью радиоиммл"ного или иммуно-ферментног метода.
За рубежом в числе скринируемых заболеваний:
Муковисцидоз.
Гистидинемия.
Галактоземия.
Лейциноз.
Тирозинсмия.
Недостаточность альфа- 1-антитрипсина.
Аргинин-янтарная ацидурия и др.
Пренатальная (дородовая) диагностика (ПД) - это диагностика состояния эмбриона и плода, основанная на элементах искусственного внутриутробного отбора генетически дефектных эмбрионов и плодов с помощью диагностики у них или-генной, или хромосомной мутации, либо врожденных аномалий развития. Она позволяет прогнозировать здоровье ребенка в семьях с отягощенной наследственностью и принять своевременные меры по прерыванию беременности с аномальным плодом. Целесообразность проведения ПД определяется, если:
Имеется вероятность рождения ребенка с тяжелым генным или хромосомным заболеванием, комплексом БАР:
Риск рождения больного ребенка выше риска осложнений ПД:
В распоряжении врача имеются тесты и необходимое оборудование. Методы ПД разнообразны и их применение зависит от срока беременности. Выделяют три группы методов ПД:
1. просеивающие.
2. неинвазивные.
3. инвазиные.
К просеивающим лабораторным методам относится определение сыворотки крови беременной веществ, получивших название сывороточных маркеров матери: альфа-фетопротеин (АФП), хорионический гонадотропин человека (ХГЧ), несвязанный эстриол (НЭ), ассоциированный с беременностью плазменный белок -А (РАРР-А).
АФП- это белок, вырабатываемый печенью плода во внутриутробном периоде его содержание меняется в течение беременности. АФП исследуется с целью выявления дефектов невральной трубки (анэнцефалия, зрта Ыйс1а). поликисгоза почек, омфалоцеле. врожденного нефроза, синдрома Дауна и др. Определяется в I триместре (10-14 недель) и во II триместре (16-20 недель). Повышение АФП выше 5-7 МОМ выявляется при пороках ЦНС. снижение уровня АФП характерно для синдрома Дауна.
В I триместре определяется также концентрация свободного ХГЧ и РАРР-А.
Во II триместре исследуется уровень концентрации в крови беременных женщин НЭ и общий и свободный ХГЧ.
Биохимический метод считают основным способом качественной диагностики разнообразных заболеваний. Проанализируем особенности данной диагностики, области применения.
Объекты диагностирования
В настоящее время биохимический метод диагностики связан с изучением пота, мочи, иных биологических жидкостей. С его помощью можно выявить активность ферментов, выяснить количественное содержание продуктов метаболизма в разных биологических жидкостях.
Биохимический метод позволяет определять нарушения, возникающие в обмене веществ, обусловленные наследственными факторами.
История открытия
В начале двадцатого века английский врач А. Гаррод занимался изучением алкаптонурии. Ему удалось установить, что по отсутствию некоторых ферментов можно установить нарушения в обмене веществ, а также определить врожденный метаболизм.
Разные наследственные болезни обусловливаются различными мутациями в генах, приводящими к изменению скорость синтеза белковых молекул, изменению их структуры. В результате таких изменений наблюдается нарушение липидного, белкового, углеводного обмена.
Биохимический метод позволяет анализировать химический состав тканей и материалов.
В случае патологии могут возникать изменения концентрации, а также появляться какие-то дополнительные компоненты. Данный метод дает возможность определять ферменты, изучать гормональный баланс.
Классификация
Биохимический метод подразделяют на качественный и количественный варианты. Для качественного определения применяют свойства, которые характерны для применяемого вещества, могут проявляться при химических реакциях: нагревании, добавлении некоторых реагентов.
Количественный биохимический метод предполагает первоначальное обнаружение вещества, затем его количественное вычисление.
Медиаторы, гормоны, содержащиеся в человеческом организме в небольшом количестве, выявляют с помощью тест-объектов.
Биохимический метод исследования постоянно совершенствуется, что дает возможность получать результат максимальной точности о процессах обмена веществ, происходящих в клетках и органах. В настоящее время такие методики диагностики объединяют с иными способами исследования, например, гистологическими, иммунными, цитологическими анализами.
Чтобы использовать сложные методики, применяют специализированное оборудование.
Биохимические методы анализа дают возможность разрабатывать и применять быстрый и упрощенный метод, позволяющий за считаные минуты определить оценку конкретных биохимических показателей.
В настоящее время аналитические лаборатории располагают современным оборудованием, автоматическими приборами и системами, позволяющими с максимальной точностью выявить необходимый показатель.
Способы проведения
Биохимический метод исследования позволяет определять различными способами какое-либо вещество в биологических жидкостях. К примеру, можно выявить такой показатель, как холестеринэстеразу, используя современное оборудование. При выборе конкретной методики учитывают характер анализируемых биологических жидкостей.
Биохимический метод изучения применяют для выявления конкретного вещества в однократном варианте, а также для изучения динамики изменений. Данный показатель анализируют при определенной нагрузке, временном показателе, в процессе приема некоторых химических препаратов.
Специфика метода
Биохимический метод генетики гарантирует быстрое выполнение анализа биологического материала. Он подходит для многократного применения, дает возможность анализировать хромосомные структуры, выявлять их кариотип. Благодаря такой методике специалисты выявляют моногенные и наследственные заболевания, связанные с полиморфизмами и мутациями генов, а также их структур.
Современные биохимические методы применяют для нахождения новых форм мутантных аллелей в ДНК. Благодаря этой методике выявили тысячу заболеваний, связанных с обменными процессами. Многие из них являются проблемами, связанными с дефектами ферментов, а также с изменениями структурных белков.
Для диагностики нарушений в обмене веществ используют две стадии. Сначала производят отбор возможных случаев болезни. Затем уточняют первоначальный диагноз, вооружившись сложными и точными методиками и оборудованием.
Например, в пренатальный период осуществляют у новорожденных детей с помощью биохимического метода анализа диагностику наследственных болезней. Это дает возможность обнаруживать патологические изменения своевременно и незамедлительно начинать лечение.
Виды биохимического анализа
Как подразделяется биохимический метод? Определение различных химических веществ осуществляется различными способами. Суть методики заключается в выявлении определенных биохимических продуктов. Причина в том, что происходит изменение действия разных аллелей. Принцип определения заключается в выявлении измененных нуклеиновых кислот и белков с помощью гель-электрофореза вместе с иными методиками: авторадиографией, блот-гибридизацией.
Биохимический анализ дает возможность выявлять гетерозиготные носители разных заболеваний. Из-за мутационных процессов, происходящих в организме человека, появляются хромосомные перестройки, негативно влияющие на здоровье человека.
Кроме того, современные биохимические методики диагностики дают возможность определять разные полиморфизмы, а также вызывают мутации различных генов.
Среди распространенных методов современной биохимии выделим центрифугирование, диализ и хроматографию.
Оптические методы исследования
Абсорбционная спектроскопия основывается на принципе определения поглощенного света, который проходит через раствор анализируемого вещества в результате абсорбции.
Для измерения спектров применяют специальные спектральные аппараты. В них помещают пробу анализируемого препарата между фотоэлементом и источником света. У каждого биологического вещества есть определенный свет поглощения.
Для проведения аналитических исследований применяют длину волны, которая соответствует максимуму поглощения анализируемого вещества.
Фотоэлектроколориметрия представляет собой определение окрашенными растворами видимого фрагмента спектра.
Спектрофотомерия, востребованная в современном анализе, представляет собой определение пропускания (поглощения) прозрачными жидкостями видимой, ультрафиолетовой и инфракрасной зон спектра.
Среди основных приборов, применяемых для измерения, выделим спектрофотометры и фотоэлектроколориметры. Эти технические приспособления позволяют проводить точные измерения в огромном диапазоне длин волн, начиная с ультрафиолета, заканчивая инфракрасной зоной спектра.
Электрофорез в современной медицине
Данное явление предполагает перемещение в электрическом поле заряженных частиц. Их поведение можно описать тремя базовыми характеристиками: скоростью движения частицы, электрофоретической подвижностью, электрокинетическим потенциалом.
Среди многочисленных методов, которые применяют для проведения аналитических исследований, именно электрофорез позволяет разделять смеси веществ на отдельные фракции, осуществлять их количественное и качественное определение. Например, подобной методикой можно провести разделение белка сыворотки крови на альбумин и четыре фракции глобулинов. Такая задача часто решается в клинической биохимии, поскольку от соотношения фракций зависит определение патологических процессов, протекающих в организме больного.
В настоящее время проводят свободный (фронтальный) электрофорез, связанный с жидкой средой, а также зональный вариант в поддерживающих средах. Ими могут выступать пористые инертные синтетические либо натуральные материалы: крахмал, ацетилцеллюлоза, бумага, синтетический полиакриламидный гель.
Задача такой среды заключается в стабилизации жидкости, снижении диффузии, создании дополнительного механизма разделения.
В последнее время стали использовать разделение по молекулярному весу совместно с электрофоретической подвижностью.
Разновидность современного анализа
Диск-электрофорез является высокоразрешающей разновидностью данного метода. Суть его заключается в том, что сначала движение молекул производится через крупнопористый концентрирующий гель, где осуществляется разделение смеси посредством движения между разными сортами ионов. Разрешающая способность метода достигается путем концентрации перед разложением пробы в небольшой стартовой зоне, разделяя при этом вещества, которые незначительно отличаются между собой по свойствам.
Хроматографические методы базируются на динамическом делении смеси биологических веществ. Суть их в том, что поток подвижной фазы, которая содержит анализируемое вещество, проходит через стационарную фазу, что сопровождается взаимодействием с компонентами образца. Фазы для данного анализа подбирают так, чтобы отличались коэффициенты распределения у компонентов смеси.
В зависимости от агрегатного состояния подвижной фазы существует подразделение хроматографических методов на жидкостный и газообразный виды. С учетом геометрической формы стационарной фазы выделяют плоскостную и колоночную хроматографию.
По механизму разделения биологических препаратов в настоящее время выделяют адсорбционную хроматографию, базирующуюся на разной адсорбционной способности компонентов разделяемой жидкости на границе раздела двух фаз.
Распределительная, или адсорбционная хроматография, базируется на разной способности поглощать объемом жидкой фазы компонентов анализируемой смеси.
Заключение
Биохимический анализ необходим для ранней диагностики серьезных заболеваний. Например, при аффинной хроматографии можно выделить определенный компонент из любой биологической смеси.
Подобная методика применяется для очистки антител и антигенов, рецепторов, ферментов, гормонов. Особая роль в биохимии принадлежит центрифугированию. Исследование и разделение веществ на основе данного метода базируется на различной скорости седиментации (оседания) в центробежном поле частичек, которые имеют различную плотность, размеры, форму. При правильном подборе скорости проведения центрифугирования можно осаждать митохондрии, рибосомы, лизосомы.
Радиоизотопные методы базируются на возможности нестабильных изотопов испускать электромагнитное излучение либо частицы, фиксируемые специальными электронными приборами.
Среди явных преимуществ всех современных методов, применяемых в медицине, выделим возможность анализировать метаболические превращения, выявлять возраст биологических препаратов. Такие исследования помогают своевременно лечить пациентов.
Современные методы изучения генетики человека .
В лабораторной диагностике наследственных болезней наряду с классическими методами широко используются современные, новые методы: цитогенетический, имунногенетический, биохимический, онтогенетический, молекулярно-генетические методы и т.д.
Биохимический метод.
Биохимический метод является основным в диагностике многих моногенных болезней, приводящих к нарушению обмена веществ. Объектами биохимической диагностики являются биологические жидкости: кровь, моча, пот, амниотическая жидкость и т.д. С помощью данного метода можно определить в биологических жидкостях активность ферментов или содержание некоторых продуктов метаболизма.
Практически во всех случаях биохимическая диагностика включает 2 уровня: первичный и уточняющий. Целью первичного уровня диагностики является исключение здоровых индивидов из дальнейшего обследования, для этого используют 2 вида программ диагностики: массовые и селективные. Массовые просеивающие программы применяют для диагностики у новорожденных таких заболеваний как фенилкетонурия, врожденный гипотериоз, муковисцедоз, галактоземия. Например, для диагностики фенилкетонурии кровь новорожденных берут на 3-5 день после рождения. Капли крови помещают на хроматографическую или фильтровальную бумагу и пересылают в лабораторию для определения фенилаланина. Для определения врожденного гипотереоза в крови ребенка на 3 день жизни определяют уровень тироксина. Просеивающая программа массовой диагностики наследственных болезней применяются не только среди новорожденных. Они могут быть организованны для выявления тех болезней которые распространены в каких либо группах населения. Например с США организована просеивающая биохимическая программа по выявлению гетерозиготнвх носителей идиотии Тей-Сакса (она чаще встречается среди евреев-ашкенази). На Кипре и в Италии организовано биохимическое исследование гетерозиготных несителей талассемии.
Селективные диагностические программы предусматривают проверку биохимических аномалий обмена у пациентов с подозрением на генные наследственные болезни.
В селективных программах могут использоваться простые качественные реакции (например, тест с хлоридом железа для выявления фенилкетонурии или тест с динитрофенилгидрозином для выявления кетокислот в моче) или более точные методы. Например, с помощью тонкослойной хроматографии мочи и крови можно диагностировать наследственные нарушения обмена аминокислот и мукополисахаридов. С помощью электрофореза гемоглобинов диагностируется вся группа гемоглобинопатий.
На сегодняшний день в нашей стране внедрена программа обязательного селективного скрининга на определение наследственных болезней обмена веществ. с проведением 14ти тестов анализов мочи и крови: на белок, кетокислоты, цистин и т.д. На втором этапе, применяя методы тонкослойной хроматографии мочи и крови, можно выявить более 140 наследственных болезней обмена веществ, такие как болезни углеводного обмена, лизосомальные болезни накопления, болезни обмена металлов, аминоацидопатии и т.д.
Широкое применение нашел биохимический метод в пренатальной диагностике врожденных пороков развития. Биохимические методы включают определение уровня альфа- фетопротеина, хорионического ганадотропина в сыворотке крови беременной. Эти методы являются просеивающими для выявления врожденных пороков развития. Например, при дефектах невральной трубки повышается уровень альфа-фетопротеина.
Цитогенетический метод.
Цитогенетический метод, основанный на изучении количества и структуры хромосом в норме и при патологии.
Основными показаниями для цитогенетического исследования являются:
1) пренатальная диагностика пола плода в семьях, отягощенных заболеваниями, сцепленными с Х-хромосомой;
2) недифференцированная олигофрения (слабоумие);
3) привычные выкидыши и мертворождения;
4) множественные врожденные пороки развития у ребенка;
5) бесплодие у мужчин;
6) нарушение менструального цикла (первичная аменорея);
7) пренатальная диагностика при возрасте матери старше 35 лет.
Этот метод стал широко применяться в медицинской практике с 1956 года, когда Тио и Леван определили, что у человека 46 хромосом. Первая классификация хромосом человека, предложенная в Денвере заложила основу для последующих номенклатур хромосом.
Наиболее современной считается Международная система цитогенетической номенклатуры хромосом человека сокращенно ISCN, принятая в Вашингтоне в 1995 году.
Согласно последней номенклатуре в хромосоме длинное плечо обозначают q , а короткое p. В каждом районе хромосомы полосы и сегменты пронумерованы последовательно от центромеры к теломере. Использование метода дифференциального окрашивания хромосом позволяет выделять индивидуальный рисунок каждой хромосомы вследствие того, что в хромосоме участки эу- и гетерохроматина по-разному окрашиваются красителями.
Объектами для цитогенетического исследования служат метафазные хромосомы, которые можно изучать с помощью прямых и непрямых методов.
Прямые – это методы получения препаратов делящихся клеток без культивирования, их используют для изучения клеток костного мозга и клеток опухолей. Непрямые методы – это методы получения препаратов хромосом из культивированных в искусственных питательных средах, например, при культивировании лимфоцитов периферической крови человека.
С помощью непрямых методов возможно проводить: кариотипирование – определение количества и качества хромосом; генетический пол организма; диагностику геномных мутаций и хромосомных аберраций. Например, синдром Дауна (трисомия по 21-й хромосоме), синдром Патау (трисомия по 13-й хромосоме), синдром Эдвардса (трисомия по 18-й хромосоме), синдром «кошачьего крика» (делеция 5-й хромосомы), синдром Вольфа-Хиршхорна (частичная моносомия 4-й хромосомы).
Для изучения половых хромосом, в частности Y-хромосомы, используют специальную окраску акрихиниприт (флюоресцирующая) и исследование проводят в ультрафиолетовом свете. Y-хроматин – это сильно светящаяся точка, обнаруживается в ядрах клеток мужского организма, и число Y-телец соответствует числу Y-хромосом в кариотипе. Окончательный диагноз хромосомной болезни выставляется только после исследования кариотипа.
Чтобы быстро определить изменения числа половых хромосом применяют экспресс-метод определения полового хроматина. Половой хроматин или тельце Барра представляет собой одну из двух X-хромосом, причем в инактивированном виде. Оно выявляется в виде сгустка треугольной или овальной формы около внутренней мембраны ядерной оболочки. В норме половой хроматин обнаруживается только у женщин. При увеличении числа Х-хромосом увеличивается и количество телец Барра. При уменьшении числа Х-хромосом (синдром Шерешевского-Тернера, кариотип 45 ХО) тельце Барра отсутствует. В норме у мужчин половой хроматин не обнаруживается, его наличие может свидетельствовать о синдроме Клайнфельтера (кариотип 47 ХХY).
Цитогенетический метод применяют для пренатальной диагностики наследственных заболеваний. Для этого проводят амниоцентез, получают амниотическую жидкость с клетками кожи плода, затем клеточный материал исследуют для дородовой диагностики хромосомных аберраций и геномных мутаций, а также пола плода. Обнаружение изменение количества и структуры хромосом дает возможность своевременного прерывания беременности с целью предупреждения потомства с грубейшими аномалиями развития.
Иммуногенетический метод.
Этот метод применяется у пациентов при подозрении на имунодефицитные заболевания (например, агаммаглобулинемии – почти полное отсутствие глобулинов в крови), при несовместимости антигенов матери и плода, для определения наследственной предрасположенности к заболеваниям при установлении отцовства.
Для диагностики имуунодефицитных состояний исследуют глобулины, Т и В-лимфоциты, нейтрофилы, макрофаги. Определяются антигены эритроцитов, лейкоцитов и сыворотки крови.
Для пренатальной диагностики можно определять HLA-антигены в лейкоцитах человека. По этим антигенам можно установить адреногенетальный синдром (или врожденная дисфункция коры надпочечников, при которой повышается синтез андрогенов в коре надпочечников). У девочек это проявляется ложным гермафродитизмом, а у мальчиков преждевременным половым созреванием.
Иммуногенетические методы достаточно дорогостоящие, но очень эффективные для определения предрасположенности к наследственным заболеваниям или для прогнозирования здоровья будущих детей.
Онтогенетический метод.
В генетике человека широко распространен онтогенетический метод. Он основан на изучении закономерности проявления какого-либо признака или заболевания в процессе индивидуального развития.
Выделяют несколько периодов развития человека: пренатальный и постнатальный. Большинство признаков формируется во время пренатального периода. После рождения заканчивается формирование коры головного мозга, постепенно формируется психика ребенка, его способность к обучению, происходит становление иммунной системы. В различные периоды развития человека происходит изменение активности генов, при чем может наблюдаться как «включение» и «выключение» генов, так и «усиление» и «ослабление» генов.
В постнатальный период, например, происходит включение генов определяющих развитие вторичных половых признаков, развитие наследственных заболеваний (сахарного диабета, близорукости, миопатии Дюшена и т.д.). В этот же период происходит выключение многих генов. Репрессируются активности генов, связанных с выработкой меланина (в результате происходит поседение волос). Не происходит синтеза эластазы (вследствие чего появляются морщины), подавляется выработка гаммаглобулинов (поэтому повышается восприимчивость к бактериальным инфекциям).
С возрастом может меняться проявление доминирования генов, находящихся в гетерозиготном состоянии, что вызывает изменение внешних признаков, особенно в период полового созревания и беременности.
В старости у человека меняется соотношение женских и мужских половых гормонов. В результате у мужчин меняется тембр голоса, форма тела, происходит отложение жира по женскому типу, меняется психика – мужчины становятся плаксивыми и впечатлительными. У женщин грубеет голос, меняется фигура.
С возрастом рецессивные гены могут оказывать большее влияние на развитие того или иного признака. У гетерозиготного по генотипу человека, например, по фенилкетонурии изменяется психика.
Наряду с «временем действия генов» выделяют и «поле действия генов». В каждой клетке человека, за исключение зрелых половых клеток содержится одинаковый диплоидный набор хромосом и одинаковый набор генов, но в процессе онтогенеза и формирования органов и тканей, одни из генов блокируются, а другие включаются в работу. Так, например, только в клетках щитовидной железы работают гены, отвечающие за синтез гормона тироксина, а в клетках поджелудочной железы – гормона инсулина. В клетках других органов тоже есть такие гены, но они блокированы.
У человека в процессе онтогенеза формируется конституция. Конституционные признаки имеют сложную генетическую основу или могут возникать в результате ранней физической нагрузки. Конституционными признаками называют такие признаки структуры, функции или поведения, которые характерны для процессов роста, созревания и старения.
Медицина стала все больше обращать внимание на конституционные болезни. Оказалось, что люди астенического телосложения более склонны к развитию туберкулеза легких, и, наоборот, у полных людей чаще наблюдается атеросклероз и гипертоническая болезнь.
Молекулярно-генетические методы.
Успехи, достигнутые в последние годы в молекулярной биологии, биохимии, медицинской генетике привели к созданию и внедрению в практическую медицину молекулярно-генетических методов. С помощью этих методов исследуется геном человека и осуществляется диагностика целого ряда наследственных и широко распространенных заболеваний. Методы ДНК-диагностики позволяют осуществлять точную и, что очень важно, доклиническую (до развития симптомов заболевания) диагностику многих заболеваний, проводить пренатальную (дородовую) диагностику наследственных болезней. Молекулярно-генетическая диагностика может быть проведена на самых ранних этапах развития эмбриона и плода независимо от биохимических или клинических проявлений болезни. Это подчас является решающим для решения вопроса о судьбе конкретной беременности.
Молекулярно-генетические методы предназначены для выявления особенностей в структуре ДНК.
У каждого человека во всех соматических клетках структура ДНК совершенно одинакова.
ДНК может быть выделена из любого типа тканей или клеток организма, содержащей ядра. Чаще всего для получения образцов ДНК используют лейкоциты периферической крови и клетки ворсин хориона.
В 70-е годы 20 века вследствие интенсивного развития молекулярной биологии и создании совершенной методической базы генетических исследований возникло направление по определению специфических нуклеотидных последовательностей ДНК и РНК – генное зондирование (гибридизационный анализ). Регистрация последовательностей небольшой длины до 30 пар нуклеотидов осуществляется с помощью синтезированных с радиоактивным мечением участков ДНК, названных зондами. Такие зонды гибридизировались с изучаемыми образцами ДНК. В этом подходе использовались универсальные свойства нуклеиновых кислот образовывать двойные нити, соединяясь между собой за счет комплиментарных нуклеотидов и образуя классические пары: аденин-тимин (АТ) и гуанин-цитозин (ГЦ). Если известна первичная структура нормального и мутантного аллелей искомого гена, то для обнаружения повреждения вводят зонд, который специфически соединяется либо с нормальным, либо с мутантным геном. Патология выявляется путем обнаружения радиоактивных импульсов на рентгеновской пленке. Этот метод широко применяется в практике диагностики наследственных болезней. В настоящее время с его помощью проводится диагностика талассемий, фенилкетонурии, недостаточности альфа-антитрипсина.
Полимеразная цепная реакция.
Полимеразная цепная реакция – это метод, имитирующий естественную репликацию ДНК и позволяющий обнаружить и копировать с помощью термостабильной ДНК-полимеразы определенный фрагмент ДНК. В основе метода лежит многоцикловый процесс, напоминающий естественную репликацию ДНК, при чем каждый цикл состоит из 3-х этапов.
На первом этапе при высокой температуре 70-80 0 С ДНК денатурируется на две отдельные цепи.
На втором этапе к определенному участку каждой цепи ДНК присоединяются праймеры. Праймеры – это последовательности нуклеотидов, специфичные для каждого гена. Они комплементарны известным нуклеотидам. Этот этап протекает при t 37 0 С.
На третьем этапе происходит синтез новых цепей ДНК при участии фермента ДНК-полимеразы, опять при высокой t. Эти этапы повторяются до получения стабильного продукта ПЦР.
Дальнейший продукт ПЦР подвергается электрофорезу и анализу.
ПЦР эффективно используют в дородовой диагностике. Достаточно небольшого количества клеток ворсин хориона или других клеток плода, чтобы исследовать их и дать через два дня заключение о наличии или отсутствии у будущего ребенка мутантного аллеля.
Сегодня молекулярно-генетические методы используются для диагностики более 300 наследственных болезней: гемофилии, гемоглобинопатий, митохондриальных болезней, муковисцедозе и т.д.
Кроме того ДНК-технологии находят свое применение для расшифровки генома человека, в судебной медицине, для определения отцовства и степени родства, для анализа клеток красного мозга донора и реципиента при трансплантации органов.
Механизм развития (патогенез) многих генных заболеваний человека связан с нарушением тех или иных звеньев обмена веществ, сопровождающихся появлением в организме повышенных концентраций определенных метаболитов. В этих случаях в диагностике заболеваний широко используют биохимические методы, позволяющие выявлять продукты нарушенного метаболизма.
Ранняя диагностика таких заболеваний обычно позволяет своевременно начать их патогенетическое лечение (проводить ту или иную коррекцию развивающегося патологического фенотипа). Поэтому уделяется большое внимание разработке «просеивающих» программ, или программ скрининга (от англ, screen - просеивать, сортировать), задачей которых является выявление наследственной патологии при массовом обследовании новорожденных с помощью тех или иных биохимических тестов. Биохимические методы можно применять и при проведении дородовой диагностики заболеваний.
Программа скрининга, как правило, осуществляется в два этапа. На первом этапе (массовый скрининг) проводят исследование больших контингентов детей (в роддомах, детских лечебно-профилактических учреждениях) с использованием относительно простых тестов. На втором этапе (селективный скрининг) уточняют диагноз и характер развития патологии у больных детей, выявленных при массовом обследовании, с помощью более сложных и точных биохимических методов исследования (электрофорез, хроматография, спектрофотометрия, спектроскопия и др.).
Примером успешного использования скринирующей программы могут служить исследования по выявлению детей с фенилкетонурией, проводившиеся в ряде стран. Как известно, в основе этого заболевания лежит блокирование основного биохимического этапа превращения фенилаланина в тирозин. При этом в организме накапливается фенилаланин, и на первое место выступает второстепенный путь его обмена, приводящий к образованию фенилпирувата. Последний не подвергается дальнейшим превращениям, накапливается в крови и тканях ребенка (в основном в форме фенилпировиноградной кислоты), вызывая хроническую интоксикацию организма (прежде всего головного мозга), и выделяется с мочой.
Широкое использование разработанных скрининг-тестов (теста Гатри, пробы с 2,4-динитрофенилгидразином, пробы Феллинга) при массовой диагностике фенилкетонурии позволили, например, в США из 28 млн обследованных новорожденных выявить 2000 больных индивидуумов. В этих случаях удалось избежать развития тяжелых проявлений заболевания путем раннего перевода таких детей на специальную диету с резким ограничением потребления фенилаланина.
Поскольку в крови больных фенилкетонурией повышается концентрация аминокислоты фенилаланина, которая выводится из организма с мочой, в диагностике заболевания практическое применение получил тест Гатри, основанный на использовании мутантных бактерий, неспособных расти на искусственной питательной среде без добавления этой аминокислоты. В указанном тесте стандартные диски фильтровальной бумаги, смоченные каплей крови (либо мочи) исследуемого ребенка, после их высушивания наносят на поверхность плотной диагностической среды в чашке Петри, предварительно засеянной соответствующими бактериями. На основании размеров зоны роста бактерий вокруг диска определяют концентрацию фенилаланина в исследуемом материале. Метод удобен и тем, что фильтровальные диски, смоченные мочой или кровью ребенка, можно пересылать по почте в специализированные лаборатории, в которых проводятся соответствующие биохимические исследования. Для уточнения диагноза в дальнейшем используют методы хроматографии и электрофореза, позволяющие определить аминокислотный состав мочи и сыворотки крови больного.
Ниже приводится краткая информация о некоторых биохимических скрининг-тестах, применяемых при массовой диагностике отдельных наследственных заболеваний, связанных с нарушением обмена веществ. Для исследования используют кровь, мочу, культивирующиеся клетки и другой материал, полученный от того или иного индивидуума.
Проба Феллинга для диагностики фенилкетонурии. К 2 мл свежей мочи добавляют шесть капель 10%-го раствора хлористого железа и уксусной кислоты, вступающих в реакцию с фенилпировиноградной кислотой. Появление сине-зеленой или серо-зеленой окраски свидетельствует о положительном результате пробы, что соответствует уровню фенилаланина в крови порядка 900-1200 мкМоль/л (норма до 120 мкМоль/л или 2 мг%).
Проба с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДНФГ) на наличие фе- нилпировиноградной кислоты. К 2 мл мочи добавляют такое же количество 0,3%-го раствора 2,4-ДНФГ. Вначале смесь прозрачна. Если в пробе имеется фенилпировиноградная кислота, то в течение 1-3 мин она приобретает ярко-желтый мутный оттенок, который сохраняется в течение суток. Применяется для диагностики фенилкетонурии.
Проба на цистин и гомоцистин. К пяти каплям мочи добавляют каплю концентрированного раствора аммиака и две капли раствора цианида натрия (2 г цианида натрия, 5 мл воды и 95 мл 96%-го этанола). Через несколько минут добавляют несколько капель 5%-го раствора нитропруссида натрия. Реакция считается положительной при появлении темно-красной окраски. Проба используется для диагностики цистинурии (повышенного содержания в моче аминокислоты цистина) и гомоцистинурии (наличия в моче гомоцистина).
Иод-азидная проба на цистин для диагностики цистинурии и гомоцистинурии. Используемый реактив: 1,5 г азида натрия растворяют в 50 мл 0,1%-го раствора йода; полученный раствор разводят в 50 мл 95%-го этанола и хранят в темном сосуде при комнатной температуре. К моче, высушенной на фильтровальной бумаге, добавляют одну каплю реактива и в течение 5 мин наблюдают за выцветанием темно-коричневой окраски. Если выцветание происходит в течение этого времени, то в образце содержится цистин или гомоцистин в повышенных концентрациях.
Тест Миллона (на тирозин). Используемый реактив: 10 г металлической ртути растворяют в 11 мл концентрированной азотной кислоты, полученный раствор медленно вливают в 29 мл дистиллированной воды. На фильтровальную бумагу, смоченную мочой обследуемого индивидуума, наносят одну каплю реактива Миллона. Появление красно-оранжевой окраски свидетельствует о положительной пробе. С помощью этого теста выявляют повышенное содержание тирозина в моче (тирозинурию) при нарушениях метаболизма этой аминокислоты, приводящих к увеличению ее концентрации в плазме крови (тирози- немии).
Проба на галактозу и лактозу. К 1 мл мочи добавляют 0,5 мл концентрированного раствора аммиака и три капли 10%-го раствора NaOH. Пробу нагревают до кипения, при появлении ярко-желтой окраски она считается положительной. Используется при диагностике галактоземии.
Проба Селиванова на фруктозу. Несколько кристаллов резорцина растворяют в 3 мл концентрированной соляной кислоты. К одному объему полученного реактива добавляют два объема мочи, смесь подогревают на водяной бане. При наличии фруктозы наблюдается интенсивное красное окрашивание. Пробу проводят для обнаружения фруктозурии при повышенном содержании этого углевода в крови больного (фруктоземии).
Проба Саржа на фруктозу. На два кристалла КОН наносят две капли мочи, при наличии в ней фруктозы появляется красное окрашивание. Пробу используют для диагностики фруктозурии.
Проба Алъгаузена на глюкозу. К 4 мл мочи добавляют 1 мл 10%-го раствора NaOH, кипятят 1 мин. Через 10 мин сравнивают результат со стандартной шкалой. При положительной пробе - окраска от желтой до интенсивной красно-коричневой. Проводят для выявления глюкозурии.
Проба с цетилтриметиламмония бромидом (ЦТАБ ) на гликозами- ногликаны (мукополисахариды ). Используемый реактив: 2,5%-ный раствор ЦТАБ в 1М цитратном буфере; pH 5,75. К 5 мл мочи добавляют 1 мл реактива. При положительном результате в течение 30 мин наблюдают образование хлопьевидного осадка. Такой результат можно получить при обследовании лиц с синдромами Марфана, Гурлера, Хантера, а также в случае ревматоидного артрита и некоторых других заболеваний.
Тест с толуидиновым синим на мукополисахариды. Используют реактив: 0,04%-ный раствор толуидинового синего в 0,2%-ной уксусной кислоте. Одну каплю мочи наносят на фильтровальную бумагу, высушивают при комнатной температуре, погружают в реактив на 1 мин, после чего отмывают в 95%-ном этаноле. Толуидиновый синий реагирует с кислыми гликозаминогликанами как катионовый краситель, давая стойкое пурпурное кольцо на голубом фоне.
Проба на порфирию. Пробу проводят с мочой или фекалиями, к которым добавляют реактив, содержащий амиловый спирт, ледяную уксусную кислоту и эфир в равных количествах. Появление бриллиантово-розовой флюоресценции при освещении ультрафиолетом свидетельствует о наличии порфирина.
ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ
- 1. Укажите, при каких из приведенных заболеваний возможно проведение массового скрининга с использованием биохимических тестов:
- а) фенилкетонурия;
- б) болезнь Дауна;
- в) трисомия X;
- г) галактоземия;
- д) тирозинемия.
- 2. Перечислите методы диагностики, применяемые при подозрении на следующие заболевания: галактоземию, фенилкетонурию, болезнь Дауна, фруктоземию.
Биохимические методы направлены на определение биохимического фенотипа организма. Уровни, на которых оценивают фенотип, могут быть разными - от первичного продукта гена (полипептидной цепи) до конечных метаболитов в крови, моче или поте. Биохимические методы чрезвычайно многообразны, и их значение в диагностике наследственных болезней постоянно возрастает. Разработка молекулярно-генетических методов диагностики частично снизила интерес к биохимическим исследованиям, но вскоре стало ясно, что в большинстве случаев указанные методы дополняют друг друга, поскольку молекулярногенетически описывают генотип, а биохимически - фенотип.
Болезнь в конечном счете - фенотип. В связи с этим, несмотря на сложность, а иногда и дороговизну биохимических методов, им принадлежит существенная роль в диагностике моногенных наследственных заболеваний. Современные высокоточные технологии (высокоэффективная жидкостная хроматография, хромато-масс-спектрометрия, газовая хроматография, тандемная спектрометрия) позволяют идентифицировать любые метаболиты, специфичные для конкретной наследственной болезни.
На первый взгляд может показаться, что самый точный метод диагностики - определение мутации на уровне ДНК. Тем не менее это не всегда так. Реализация действия гена - сложный процесс, поэтому нормальная структура гена, а точнее - отсутствие мутации, не всегда служит полной гарантией нормального биохимического фенотипа.
Принципы биохимической диагностики наследственных болезней менялись в процессе развития генетики человека и биохимии. Так, до 50-х годов XX в. диагностика была направлена на поиски специфичных для каждого заболевания метаболитов в моче (алкаптонурия, фенилкетонурия).
С 50-х до 70-х годов упор в диагностике был сделан на обнаружение энзимопатий. Разумеется, поиски метаболитов в конечных реакциях при этом не исключались. Наконец, с 70-х годов главным объектом диагностики стали белки разных групп. К настоящему времени все они служат предметом биохимической диагностики.
Оценка метаболитов в биологических жидкостях - необходимый этап диагностики аминоацидопатий, органических ацидурий, мукополисахаридозов, митохондриальных и пероксисомных болезней, дефектов метаболизма пуринов и пиримидинов и др. Для этих целей используют методы качественного химического анализа, спектрофотометрические способы количественной оценки соединений, а также различные виды хроматографии.
Хроматографические методы анализа играют важнейшую роль в диагностике наследственных болезней обмена (НБО). Это обусловлено тем, что современный арсенал хроматографических технологий чрезвычайно широк и позволяет эффективно и информативно разделять сложные многокомпонентные смеси, к которым в том числе относят и биологический материал.
Для количественного анализа маркеров-метаболитов НБО успешно применяют такие хроматографические методы, как газовая и высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), а также хромато-масс-спектрометрия (ХМС). Газовая хроматография и ВЭЖХ - универсальные методы разделения сложных смесей соединений, отличающиеся высокой чувствительностью и воспроизводимостью. В обоих случаях разделение осуществляют в результате различного взаимодействия компонентов смеси с неподвижной и подвижной фазами хроматографической колонки. Для газовой хроматографии подвижной фазой служит газ-носитель, для ВЭЖХ - жидкость (элюент). Выход каждого соединения фиксирует детектор прибора, сигнал которого преобразуется в пики на хроматограмме. Каждый пик характеризуется временем удерживания и площадью. Следует отметить, что газовую хроматографию проводят, как правило, при высокотемпературном режиме, поэтому ограничением для ее применения считают термическую неустойчивость соединений. Для ВЭЖХ не существует подобных ограничений, так как в этом случае анализ проводят в мягких условиях.
Масс-спектрометрия - аналитический метод, с помощью которого можно получать как качественную (структура), так и количественную (молекулярная масса или концентрация) информацию об анализируемых молекулах после их преобразования в ионы.
Существенное отличие масс-спектрометрии от других физико-химических аналитических методов состоит в том, что в масс-спектрометре определяют непосредственно массу молекул и их фрагментов. Результаты представляют графически (так называемый масс-спектр). Иногда невозможно анализировать сложные многокомпонентные смеси молекул без их предварительного разделения. Это можно сделать либо хроматографически (жидкостная или газовая хроматография), либо использовать два последовательно соединенных массспектрометра (тандемная масс-спектрометрия - ТМС). ТМС позволяет охарактеризовать структуру, молекулярную массу и провести количественную оценку 3000 соединений одновременно. При этом для проведения анализа длительная подготовка проб не требуется (как, например, для газовой хроматографии), а время исследования занимает несколько секунд.
ТМС - одно из перспективных направлений в развитии программ диагностики НБО, поскольку позволяет количественно и в микроколичествах биологического материала определять множество метаболитов. В настоящее время в некоторых странах ТМС применяют для массового скрининга новорожденных на наследственные болезни.
В связи с многообразием биохимических методов, применяемых в лабораторной диагностике наследственных болезней, в их использовании должна быть определенная система. У пробанда или члена его семьи нереально исключить все наследственные болезни, которые могут попасть в поле зрения при обследовании пациента. Если применять максимально возможное число методов диагностики, то каждое обследование станет очень трудоемким и долгим. Исходную схему обследования строят на клинической картине болезни, генеалогических сведениях и биохимической стратегии, которые позволяют определить ход обследования на основе поэтапного исключения определенных классов наследственных болезней обмена (просеивающий метод).
Необходимо подчеркнуть, что, в отличие от цитогенетических и молекулярногенетических исследований, биохимические методы многоступенчаты. Для их проведения требуется аппаратура разных классов. Материалом для биохимической диагностики могут быть моча, пот, плазма и сыворотка крови, форменные элементы крови, культуры клеток (фибробласты, лимфоциты) и биоптаты мышц. При использовании просеивающего метода в биохимической диагностике можно выделить два уровня: первичный и уточняющий. Каждый из них может быть по-разному «нагружен» реакциями в зависимости от возможностей лаборатории.
Основная цель первичной диагностики заключается в том, чтобы обнаружить здоровых людей и отобрать пациентов для последующего уточнения диагноза. В программах первичной диагностики в качестве материала используют мочу и небольшое количество крови. Программы могут быть массовыми и селективными.
Селективные диагностические программы предусматривают проверку биохимических аномалий обмена (моча, кровь) у пациентов с подозрением на генные наследственные болезни. Фактически они должны функционировать в каждой большой больнице. Показания для их применения достаточно широкие, а стоимость каждого анализа невысока.
В селективных программах можно использовать простые качественные реакции (например, тест с хлоридом железа для диагностики фенилкетонурии или с динитрофенилгидразином для обнаружения кетокислот) или более точные методы, позволяющие обнаруживать большие группы отклонений. Газовую хроматографию применяют для диагностики НБО органических кислот и ряда аминоацидопатий. С помощью электрофореза гемоглобинов диагностируют заболевания из группы гемоглобинопатий.
Нередко приходится углублять биохимический анализ от количественного определения метаболита до измерения активности фермента (использование нативных тканей или культивированных клеток), например, с помощью спектрофлюориметрии или спектрометрии (в зависимости от применяемого субстрата). Следует отметить, что определение активности ферментов при наследственных заболеваниях - не рутинная процедура, проводимая только в специализированных лабораториях. В современных условиях очень многие этапы биохимической диагностики выполняют автоматически, в частности с помощью аминоанализаторов.
Селективные диагностические программы обеспечивают только предположительное обнаружение больных с НБО. Методы подтверждающей диагностики включают количественное определение метаболитов, исследование их кинетики, энзимо- и ДНК-диагностику.
Показания для применения биохимических методов диагностики у новорожденных: нарушения сознания, судороги, нарушения ритма дыхания, мышечная гипотония, нарушения вскармливания, желтуха, специфический запах мочи и пота, метаболический ацидоз с дефицитом оснований и гипогликемия. У детей более старшего возраста биохимические методы используют во всех случаях подозрения на НБО (задержка физического и умственного развития, потеря приобретенных функций, увеличение размеров внутренних органов), а также при клинической картине, специфичной для определенного заболевания.
Биохимические методы применяют для диагностики наследственных болезней и гетерозиготных состояний у взрослых (гепатолентикулярная дегенерация, недостаточность α1-антитрипсина, недостаточность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и др.). При диагностике многих болезней биохимические методы заменяют молекулярно-генетическими в связи с их большей точностью или экономичностью. Принципиально важным считают правильное сочетание тех и других методов.
Внедрение и использование УМК «Изучаем русский язык» в двуязычной образовательной среде
Система образования в индии как фундамент знаний и жизни
Роман Вишневский – трейдер и владелец брокерской компании
Николай Кольцов – биолог из будущего